基因克隆与表达ppt课件
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基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
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G
3`
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mRNA
5` RP
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AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
分子生物学实验技术ppt课件
质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建
克隆基因的表达
实际的启动子中很少具备与上述序列完全一 致的区域，启动子的这两个区域与上述保 守序列的相似程度越高，该启动子的表达 能力也就越强。
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
第六章克隆基因的表达ppt课件
起始密码子及其5端若干密码子的影响：
90%以AUG为起始密码子，少数UUG、GUG。
AUG右侧的几个密码碱基组成也有影响，不能与 mRNA的5’端非编码区形成茎环结构。
4. 生物体对密码子的偏爱性：
简并密码子使用频率在不同 不
同蛋白质翻译时不同，具有偏
➢外源基因密码子在大肠杆菌细胞中获得
最佳表达：
简单，便于基因操作和分析。
（2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应
表达载体， 目标基因表达水平高。
（3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚 （4）繁殖迅速、培养简单、操作方便 （5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 表达载体的必要元件 密码子 质粒拷贝数
3、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程
度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的
拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的效表达外源基因？ 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 什么是RBS位点，如何影响基因表达？ 什么是包涵体？其形成机理是什么？ 融合蛋白、寡聚型异源蛋白 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？
➢ DNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型
染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组， 其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间 距离有关。
➢同源重组有整合和交换两种形式，前者只
需要一个断裂位点，后者有两个断裂位点。
标记基因
目的基因
同源交换
标记基因
目的基因
三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策
基因的克隆与表达PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
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17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
《基因克隆与表达》课件
总结基因克隆与表达的重要性，并鼓励进一步学习和研究。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
2 留下问题和展望
引发学生对基因克隆与表达的思考和问题，并展望该领域的未来发展。
什么是基因克隆与表达
解读基因克隆与表达的定义， 了解其在基因研究中的作用。
基因克隆和表达的重要 性
探讨基因克隆与表达在科学 研究和应用中的重要价值。
课程大纲介绍本课程的内容和学习 Nhomakorabea 标，为后续的学习做好准备。
基因克隆
基因克隆是获取目标基因及其背后的DNA片段的过程。PCR、限制性酶切和连接反应是基因克隆中常用的关键 技术。
2 重组蛋白表达
探讨重组蛋白表达的步骤以及在基因工程和生物医药领域中的可行表达体系选择。
3 基因治疗
介绍基因治疗的原理和在疾病治疗中的应用前景。
结论
在基因研究和应用中，基因克隆和表达起着至关重要的作用。通过了解相关技术和应用，我们可 以更好地理解基因的功能和探索其在生物科学中的潜力。
1 基因克隆和表达的重要性再强调
PC R
探讨聚合酶链式反应（PCR）在 基因克隆中的原理、步骤和应 用。
限制性酶切
介绍限制性酶切的原理及其在 基因克隆中的应用。
连接反应
讨论连接反应在基因克隆中的 原理、步骤和应用。
基因表达
基因表达是指利用转化和重组蛋白表达系统来实现基因功能研究和基因治疗的过程。
1 转化
深入解析转化的原理、步骤和转化后的检测方法。
《基因克隆与表达》PPT 课件
这是一份专业的《基因克隆与表达》PPT课件，将带你深入了解基因克隆和表 达的重要性以及相关技术。通过本课件，你将掌握基因克隆和表达的关键步 骤和应用。
简介
基因克隆与表达是研究基因结构和功能的重要方法。本课程将介绍基因克隆与表达的基本概念、原理和技术， 并探讨其在生物科学研究和应用中的重要性。
基因克隆与表达
蛋白原核表达
精选2021版课件
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAG精E选2021版课件
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
精选2021版课件
5
1、连接
连接、转化与重组子鉴定
精选2021版课件
6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
精选2021版课件
7
2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度 不高，连接缓冲液宜分装；
单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
精选2021版课件
15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
精选2021版课件
+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
精选2021版课件
精选2021版课件
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAG精E选2021版课件
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、 SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
精选2021版课件
5
1、连接
连接、转化与重组子鉴定
精选2021版课件
6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条双链DNA。
（2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。
（3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
精选2021版课件
7
2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度 不高，连接缓冲液宜分装；
单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
精选2021版课件
15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
精选2021版课件
+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
精选2021版课件
分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。
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15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
17
凝胶浓度:
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；
浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
♦ 凝胶分辨DNA的能力：
琼脂糖
浓度 分辨范围(kb)
0.3%
5-60
0.6%
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解 度不高，连接缓冲液宜分装； 单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
8
4）插入片段与载体的浓度比例
载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通
常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。
目的或作用：
蛋白原核表达
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAGE
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙 醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
1-20
0.7%
0.8-10
0.9%
0.5-7
1.2%
0.4-6
1.5%
0.2-3
聚丙烯酰胺凝胶
浓度 分辨范围(bp)
3.5 1000-2000
5
90-500
8.0 60-400
12
40-200
15
25-160
20
6-100
凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小
原来如 此！
18
电泳缓冲液
pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大
增加插入片段与载体的接触机会，减 少载体自我连接的现象。
9
2、转化
化学法（CaCl2法)： 转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下 形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作 用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分 子便可进入细胞内（感受态细胞）。
10
影响转化率的主要影响因素:
载体本身的性质及其空间构象：超螺 旋构象转化率最高； 插入片段的大小：插入片段越大，转 化效率越低； 受体细胞的类型及预处理；
25
菌株种类
BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione
14
ⅲ 抽提出质粒的构型：
1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中， 超螺旋DNA占大部分。
2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中 有一条链发生一处或多处断裂，分子就能 旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状 分子，称开环DNA。
3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在 同一处断裂，则形成线状DNA。
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。
4
使用时注意事项：
• 用时在冰上操作；
关心小 贴士告
诉你
• 取酶用干燥、灭菌、新的枪头
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
2）. DNA的甲基化程度
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
3
3）. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不 同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
4）. 缓冲液(Buffer)
是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
5
1、连接
连接、转化与重组子鉴定
6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
7
2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
转化方法：电击法高于化学法。
11
3、转化子的筛选和鉴定
限制性酶切图谱法
Pvu I Pst I
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
Sal I
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
12
质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环 的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细 胞中。
• T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导 时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导 条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、 λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。
24
T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
发热快胶溶解 种类：
TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集 TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强 TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低 TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）
19
pET表达载体
20
21
22
23
• pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动 子），需要T7RNA聚合酶才能转录。
质粒具有自主复制 和转录能力，能在子 代细胞中保持恒定的 拷贝数，并表达所携 带的遗传信息。
基因组DNA
质粒DNA
13
ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂， 结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分 变性。在中性条件下变性质粒恢复原来 构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈 不溶物而经离心除去。
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
-
电 泳 方 向
+
16
凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
17
凝胶浓度:
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；
浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
♦ 凝胶分辨DNA的能力：
琼脂糖
浓度 分辨范围(kb)
0.3%
5-60
0.6%
3）反应液中的成分：
ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解 度不高，连接缓冲液宜分装； 单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率
8
4）插入片段与载体的浓度比例
载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通
常为1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。
目的或作用：
蛋白原核表达
卫文强 2015.112
目的基因-T
表达载体
酶切， 胶回收，连接
转化到克隆用细胞（Top10)
提质粒，酶切验证
转化到表达用细胞（BL21（DE3)）
诱导表达
SDS-PAGE
2
影响限制性内切酶活性的因素
1）. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙 醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
1-20
0.7%
0.8-10
0.9%
0.5-7
1.2%
0.4-6
1.5%
0.2-3
聚丙烯酰胺凝胶
浓度 分辨范围(bp)
3.5 1000-2000
5
90-500
8.0 60-400
12
40-200
15
25-160
20
6-100
凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小
原来如 此！
18
电泳缓冲液
pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大
增加插入片段与载体的接触机会，减 少载体自我连接的现象。
9
2、转化
化学法（CaCl2法)： 转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下 形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作 用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分 子便可进入细胞内（感受态细胞）。
10
影响转化率的主要影响因素:
载体本身的性质及其空间构象：超螺 旋构象转化率最高； 插入片段的大小：插入片段越大，转 化效率越低； 受体细胞的类型及预处理；
25
菌株种类
BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione
14
ⅲ 抽提出质粒的构型：
1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中， 超螺旋DNA占大部分。
2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中 有一条链发生一处或多处断裂，分子就能 旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状 分子，称开环DNA。
3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在 同一处断裂，则形成线状DNA。
MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度；
Tris-HCl：
维持pH；
二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；
牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；
β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。
4
使用时注意事项：
• 用时在冰上操作；
关心小 贴士告
诉你
• 取酶用干燥、灭菌、新的枪头
• 酶用量不能超过酶切总体积的10%；
2）. DNA的甲基化程度
dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
3
3）. 温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不 同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。
4）. 缓冲液(Buffer)
是影响限制酶活性的重要因素。 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
• 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲 液；
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1、连接
连接、转化与重组子鉴定
6
（2）. 连接条件
（1）必须是两条5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量
动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+
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2）连接温度：
连接效果最好在37 ℃，但形成的互补 不稳定; 最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连 接效果，互补又较稳定;
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导
T7 RNA 聚合酶
lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
转化方法：电击法高于化学法。
11
3、转化子的筛选和鉴定
限制性酶切图谱法
Pvu I Pst I
EcoR I
Cla I
Pst I
Hind III
BamH I
Apr
Tcr
pBR322
Sal I
4363 bp
ROI
ori
ROP
Bal I
Hind II
12
质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环 的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细 胞中。
• T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导 时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导 条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、 λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。
24
T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
发热快胶溶解 种类：
TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集 TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强 TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低 TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）
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pET表达载体
20
21
22
23
• pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动 子），需要T7RNA聚合酶才能转录。
质粒具有自主复制 和转录能力，能在子 代细胞中保持恒定的 拷贝数，并表达所携 带的遗传信息。
基因组DNA
质粒DNA
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ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂， 结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分 变性。在中性条件下变性质粒恢复原来 构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈 不溶物而经离心除去。