实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定 (3)
谷丙转氨酶活力测定
谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。
熟悉转氨酶活性测定的操作方法。
了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。
二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。
参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。
卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。
血清谷丙转氨酶的测定实验报告
血清谷丙转氨酶的测定实验报告血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）是一种重要的肝脏酶，其测定可以用于评估肝功能和诊断肝脏疾病。
本实验旨在通过测定血清中ALT的活性，探究其在肝功能评估中的应用。
实验材料与方法。
1. 实验材料，实验所需材料包括ALT检测试剂盒、标准品、血清标本、比色皿、移液管等。
2. 实验方法：a. 样本处理，将采集的血清标本离心，取上清液置于4℃保存。
b. 实验操作，按照ALT检测试剂盒说明书进行操作，制备标准曲线和待测样本的反应体系。
c. 光度测定，使用分光光度计测定各标准品和待测样本的吸光度值。
d. 计算ALT活性，根据标准曲线计算待测样本中ALT的活性。
实验结果与分析。
经过实验测定，得到不同浓度的ALT标准曲线，吸光度与ALT浓度呈线性关系，相关系数达到0.99以上。
待测样本的吸光度值为X，通过标准曲线计算得到其ALT活性为Y。
进一步分析发现，实验组ALT活性显著高于对照组，说明实验组受到了肝脏损伤。
实验结论。
本实验通过测定血清中ALT的活性，成功评估了肝功能并诊断了肝脏疾病。
实验结果表明，ALT活性的升高与肝脏损伤密切相关，可作为肝功能评估和肝脏疾病诊断的重要指标之一。
实验注意事项。
1. 实验操作中需严格按照操作规程进行，避免操作失误导致结果误差。
2. 实验过程中需注意安全，避免接触有害化学品和受伤。
3. 实验结果需结合临床资料进行分析，以获得准确的诊断结论。
实验展望。
未来，可以进一步探究ALT在肝脏疾病诊断中的应用，寻找更为准确、快速的检测方法，为临床诊断提供更可靠的参考。
结语。
通过本实验，我们深入了解了血清谷丙转氨酶的测定方法和应用，为肝功能评估和肝脏疾病诊断提供了重要的实验依据。
希望本实验能对相关领域的研究和临床应用提供一定的参考价值。
试验三、转氨酶活力测定
3）、向空白与样品管中分别加入0.5 mL 2，4－二硝基 苯肼，摇匀，水浴保温15分钟。
4）、向空白管中加入0.1 mL血清，摇匀。
5）、向所以3支试管中都加入5.0 mL 0.4 M NaOH溶液， 摇匀并水浴保温15分钟后在520 nm进行比色测定。
保温30分钟
五、实验结果
1、用测定吸光值在标准曲线上查出丙酮酸的生成量 2、计算：
六、酶活力单位的定义
国际单位：在最适温度下，1分钟内转化1μmol底物的 酶量称为1个酶单位（U）。
Katal单位：在一定条件下，1秒钟内转化1mol底物所 需要的酶量。 1 U＝16.67 nKat 1 Kat ＝6 107 U
七、注意事项
1. 在测定谷丙转氨酶活力时，应事先将底物、血清在37℃水 浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。 2.转氨酶只能作用于α-L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。实验 室多用α-DL-氨基酸。 3. 进行样品测定时，加入2,4-二硝基苯肼溶液后要摇匀并保 温15分钟。 4. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。
2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL） 3.谷-丙转氨酶底物溶液 (含α-酮戊二酸2 μmol/ml及DL-丙氨酸200 μmol/ml) 4. 2.4二硝基苯肼溶液 (0.02%,1mol/L HCl溶液) 5. 0.4mol/L NaOH溶液 。
四、实验操作
1、标准曲线制作： 1）、取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5编号。 先将试管置于37℃恒温水浴中保温5分钟以平衡内外 温度。然后按下表所列的次序添加各试剂。
一．实验原理 转氨作用 指在转氨酶催化下 将-氨基酸的氨基转给 另一个-酮酸，生成相 应的-酮酸和一种新的 -氨基酸的过程,也称氨 基移换作用。
肝脏谷丙转氨酶活力测定
一、实验目的
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成谷氨酸与丙 酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此 物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色， 求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。
C O O H 500：标准丙酮酸浓度 2.
37℃ 水浴5 分钟
0.1
0.1（标准丙酮酸） 0.1
混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟
0.1（H2O）
0.5
0.5
0.5
0.5
——
——
0.5
0.5
混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟
各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm 0.000
六. 附注
➢2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异 性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而 显色。 ➢2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白 管颜色较深。
2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
C H 4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2. 2 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g） C H 2 C H 3 5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。
S ×2.
C H N H 新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏） 2 5：谷丙转氨酶换算单位 C O O H 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 现配 2.谷丙转氨酶底物 4℃，1周
二硝基苯肼溶液
6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
处理：20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的0.1M pH7.4 PB捣
血清谷丙转氨酶ALT(精)
光度。由测得的吸 A 光度在曲线上查得
试样溶液中待测组
分的浓度，最后计
算得到试样中待测
组分的含量。
0
浓度C
几点注意：
(1) 理想的标准曲线应为：用不同浓度标准 溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是 一条斜率接近于1通过原点的直线；
(2) 标准溶液浓度范围应在被测物质浓度的 一半到二倍之间；
(3) 吸光度在0.05---1.0之间为宜。
A样 = KC样L
A标
KC标L
则：
C样 =
A样 A标
C标
2. 标准曲线法
(1) 配制一系列不同
含量的待测组分的 吸
标准溶液，以不含
光 度
待测组分的空白溶 A
液为参比，测定标
准溶液的吸光度。
并绘制
吸光度—浓度曲线
0
浓度C
(2) 得到标准曲线
（工作曲线），然
后再在相同条件下 吸
测定试样溶液的吸
光 度
四、操作步骤
五、注意事项
1.血清样品的测定需在显色后30分钟内完 成。
2.在血清中加入底物后，应准确记时。
பைடு நூலகம்
六、实验的结果
• 1.第一组同学绘制标准曲线 • 2.其余组的同学做ALT活性的测定 • 实验报告要求2项都完成
七、讨论与小结
实验三
血清谷丙转氨酶（ALT) 活性的测定
一、实验目的：
• 进一步掌握分光光度法基本原理和应用 • 通过实验, 理解酶促反应的原理 • 掌握反应原理、操作步骤及标准曲线的
绘制。
二、原 理
三、方法
分光光度法----标准曲线法
定量分析方法
1. 对比法
将标准与样品分别在相同条件下显色，测 定其吸光度。因是相同物质在相同条件下 测定，故可按下式计算出样品的浓度：
实验十 血液转氨酶(谷丙转氨酶)活力的测定
实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。
或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。
3、熟悉分光光度计的使用。
【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。
它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。
当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。
从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。
现用现配。
2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。
然后用1M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。
谷丙转氨酶活性测定
最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升，
在室温下静置30分钟后，
以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制
在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶 （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。
上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 它们的催化反应如下：
试剂
管号 0
1
2
3
4
5
丙酮酸钠标准液/ml 0.00
0.05
0.10 0.15 0.20 0.25
谷丙转氨酶底物/ml 0.50
0.45
0.40 0.35 0.30 0.25
磷酸缓冲溶液 0.10
0.10
0.10 0.10 0.10 0.10
(0.1M pH7.4) /ml
37℃水浴中保温， 平衡管 内外温 度
本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。
→
二、实验用品
1、材料 新鲜动物肝匀浆。
2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4）
取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）：
取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 内（宜当日新配）。
血清谷丙转氨酶的测定实验报告
血清谷丙转氨酶的测定实验报告血清谷丙转氨酶的测定实验报告引言：血清谷丙转氨酶（AST）是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，主要参与氨基酸代谢过程。
AST的测定在临床上具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。
本实验旨在通过酶促动力学方法测定血清中AST的活性，并分析实验结果。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 血清标本：从健康志愿者采集的血样。
- AST测定试剂盒：包括底物、辅酶、酶标试剂等。
- 酶标仪：用于测定底物的光吸收值。
2. 实验方法：- 步骤一：标定酶标仪将已知浓度的AST酶标溶液分别加入不同的试管中，测定其对应的光吸收值，建立标准曲线。
- 步骤二：制备样本将采集到的血清标本离心，取上清液，稀释至适宜浓度。
- 步骤三：测定AST活性将标定好的试剂和稀释后的血清标本加入试管中，混匀后，放入酶标仪中测定吸光度。
- 步骤四：计算AST活性根据标准曲线，计算出各个样本的AST活性。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一系列样本的AST活性数据。
根据标准曲线，我们可以计算出每个样本的AST活性，并进行进一步的分析。
首先，我们可以观察到不同样本之间AST活性的差异。
正常情况下，AST活性在一个相对稳定的范围内，超出该范围可能提示肝脏功能异常或疾病存在。
因此，通过测定AST活性，我们可以初步判断一个人的肝脏健康状况。
其次，我们还可以对不同条件下AST活性的变化进行研究。
例如，我们可以比较不同性别、不同年龄段、不同体重指数的人群的AST活性是否存在差异。
这样的研究有助于进一步了解AST在人体内的生理变化和代谢过程。
此外，我们还可以将AST活性与其他临床指标进行关联分析。
例如，我们可以比较AST活性与肝功能指标、炎症指标等之间的关系。
这些关联分析可以为临床诊断和治疗提供重要的参考依据。
总结：通过本实验，我们成功地测定了血清中AST的活性，并对实验结果进行了分析和讨论。
AST的测定在临床中具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。
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实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定
【目的和要求】
了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。
【原理】
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。
转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。
它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。
当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。
从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【操作方法】
2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。
底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。
因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。
先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。
向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。
在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。
用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。
2．酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管。
各加入谷丙转氨酶底物0.5ml,置于37℃水浴内10min，使管内外温度平衡。
取血清0.1ml加到第1号试管内，继续保温60min。
到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5ml，于37℃保温20min,然后再向2支管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。
在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值（显色后30min 至2小时内其色度稳定）。
在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。
（用1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力）。
计算每100ml血清中转氨酶的活力单位数。
【试剂和器材】
一`试剂
1．试管及试管架
2．吸管
3．恒温水浴
4．分光光度计
二`器材
1．0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）
2．2.0μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。
取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内[当日配制]。
3．谷丙转氨酶底物。
取分析纯α-酮戊二酸29.2mg DL-丙氨酸1.78g克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4后，加磷酸缓冲液至100ml。
然后加氯仿数滴防腐。
此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0μmol，丙氨酸200μmol。
[在冰箱内可保存一周]。
4．2，4-二硝基苯肼溶液。
在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼19.8mg，加100ml 1 mol/L盐酸。
把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内置[冰箱内保存]。
5．0.4mol/L氢氧化钠溶液。
6．人血清[冰箱内保存]。