谷丙转氨酶(GPT)活性测定试剂盒说明书
第三章实验二肝匀浆中谷丙转氨酶_GPT_活力的测定
H2 O
OH
红棕色
A520nm
主要仪器、试剂、材料
剪刀，天平，组织捣碎机，水浴锅，分光光度计（520nm）， 比色皿，计算纸，移液管。
新鲜肝脏；标准丙酮酸（丙酮酸钠62.5 mg，溶于100mL 0.05M 的H2SO4中）；0.1M PBS溶液（13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于 1L蒸馏水中，pH7.4）；谷丙转氨酶底物（0.9g L-Ala和29.2mg α-酮 戊二酸，溶于上述PBS溶液中，然后用1M NaOH调pH 7.4，继续用 PBS稀释至100mL，4℃保存）；0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液（20mg 2,4-二硝基苯肼溶于1M HCl溶液中，并用1M HCl定容至100mL）； 0.4 M NaOH；生理盐水。
实验步骤
1. 肝匀浆处理：取新鲜肝脏10g，先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再 用预冷的0.1M pH7.4 PBS捣碎，并定容至100 mL。 2. 谷丙转氨酶活力的测定 1）取4支试管，标注名称，按照下表操作。
试管
试剂 (mL) 谷丙转氨酶底物
肝匀浆
2.4-二硝基苯肼 谷丙转氨酶底物
0.4M NaOH A 520nm
2）计算酶活力 本法规定：酶在37℃ 与底物作用30分钟，产生2.5μg 丙酮酸为一个 谷丙转氨酶活性单位。 3. 计算：每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
D = （A—B）× 500 × 100 S ×2.5×10
说明： A：样品吸光值 B：对照吸光值 S：标准吸光值 500：标准丙酮酸浓度 2.5：谷丙转氨酶换算单位 100：100mL肝匀浆 10：10g肝
问题：如何测定谷丙转氨酶的活力？
实验24. 肝匀浆中谷丙转氨酶活力的测定
实验六肝脏谷丙转氨酶活力测定
肝脏谷丙转氨酶活力测定进入实验室要注意的问题安全第一，在实验室中使用挥发性试剂时应在通风橱中进行，以免发生中毒事件；不得在实验室中随意使用明火，因为实验室中有许多易燃易爆药品，使用明火可能引起火灾或引发爆炸事件；不得在实验室吃东西，实验结束后也应将手洗净再吃东西。
在实验室中不得嬉戏打闹，更不得用实验药品互相开玩笑。
实验中使用药品应尽量节约，不得浪费药品，未使用完的药品因倒人废液缸或指定的容器中，切不可倒入原试剂瓶以免污染试剂。
实验完成之前不能离开实验室，如有特殊原因要离开需经实验室负责人批准才能离开。
每个实验台内的各种仪器的摆放顺序要牢记，离开实验室前要将仪器按顺序摆放好。
养成一个好的习惯。
一．实验目的了解转氨酶的性质及临床意义，并掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二．实验原理在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基为大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。
本实验以丙氨酸和ā-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。
丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。
ā--酮戊二酸与能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处ā--酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和ā--酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。
故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。
三、实验器材容量瓶100ml 4个500ml 2个；电子天平；玻璃棒；研钵；试管5支；试管架；移液管0.5ml 2支；1ml 2支；5ml 1支；滴管1支；分光光度计，比色皿4个；四.实验试剂1标准丙酮酸溶液：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.05mol/L H2SO4中，现用现配。
谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性的测定
谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性的测定（一）主要仪器与试剂1.主要仪器设备高速离心机, 恒温水浴锅,722G 分光光度计2.主要试剂(1)0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2)：0.2mol/ L 三羟甲基氨基甲烷(24.2g 三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml)50ml 和0.2mol/L HCl 44.2ml , 用蒸馏水稀释至200ml。
(2)0.1mol/L 磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(AR)11.928g, 磷酸二氢钾(AR)2.176g, 加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。
(3)2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4 -二硝基苯肼19.8mg, 用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml , 保存于棕色瓶中备用, 此液可保存3 个月。
(4)0.4mol/L 氢氧化钠溶液：16g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。
(5)1mol/L氢氧化钠溶液：40g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。
(6)丙酮酸标准液(2μmol/ml)：精确称取纯丙酮酸钠22.0mg 于100ml 容量瓶中, 加0.1mol/L 磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制。
(7)GOT 底物液(DL-门冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L)：称取α-酮戊二酸29.2mg 和DL-门冬氨酸 2.66g 置于一小烧杯中,加入1mol/L 氢氧化钠20.5ml 使溶解,并校正pH 至7.4, 然后将溶液移入100ml容量瓶内, 用0.1mol/L 磷酸盐缓冲液定容至刻度。
放置冰箱内保存。
(8)GPT 底物液：(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):称取α-酮戊二酸29.2mg 和DL-丙氨酸 1.79g置于一小烧杯中, 加入0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4)约80ml 煮沸溶解后,待冷, 用1mol/L氢氧化钠调pH 至7.4(约加0.5ml), 再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至100ml 混匀,加氯仿数滴防腐, 贮于冰箱内。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(单试剂速率法)
丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(单试剂速率法)简介：转氨酶是催化α-氨基酸和α-酮酸之间氨基转换反应的一组酶，丙氨酸氨基转移酶(ALT)旧称谷丙转氨酶(GPT)主要存在于肝细胞浆内，细胞内ALT 浓度远高于血清，肝细胞破坏后，血清ALT 立即迅速升高，因此谷ALT 被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
Leagene 丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(单试剂速率法)其检测原理是丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移反应，丙酮酸与NADH 经LDH 催化成NAD +，上述方法实际为ALT 速率法，在上述偶联反应中，NADPH 的氧化速率与样本中酶活性呈正比。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、 准备样品：① 血浆、血清样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃保存1个月有效，用于ALT/GPT 的检测。
② 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行匀浆，低速离心取上清，-20℃保存1个月有效，用于ALT/GPT 的检测。
③ (选做)样品准备完毕后可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的ALT/GPT 含量。
2、 分光光度计检测：按照下表设置对照管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。
如果样品中的酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
编号 名称TE0125 100TTE0125 200TStorageALT 检测液(R)成分 终浓度 2×50ml 2×100ml 4℃ 避光Tris 缓冲液 100mM L-丙氨酸 500mM 酮戊二酸 15mM NADH 0.22mM LDH 1700U/L 防腐剂 15mM使用说明书1份加入物空白管测定管ALT检测液(R)(μl) 900 900混匀，3孵育。
蒸馏水(μl) 45 －待测样品(μl) －45混匀孵育，在340nm处1-3min各管吸光度变化，计算各管ΔA/min。
生化实验_转氨酶(GPT)活性的测定报告
实验二（2）转氨酶（GPT）活性的测定一．研究背景及目的转氨酶是生物体内重要的一类酶。
转氨酶催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸，这种作用被称为转氨基作用[1]。
转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶。
其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。
GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用，可作为一些疾病诊断的指标。
GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转变为丙酮酸与二氧化碳。
由于都有丙酮酸的生成，所以可以通过实验测定一定时间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性。
本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。
二．原理由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高，易于测得，且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料，对其中的一种重要转氨酶——GTP的活性进行测定。
转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法，本实验采用的是金氏法。
该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃，pH7.4条件下，与底物作用60min后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。
丙酮酸含量的测定运用的是比色法。
丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。
三．材料、试剂与仪器材料：新鲜家兔肝脏和血清试剂[1]：①磷酸盐缓冲液（pH7.4）甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液乙液：1/15 mol/L磷酸氢二钾溶液取甲液825ml，乙液175ml，混合，测得pH为7.4即可。
肝脏谷丙转氨酶活力测定
实验八 肝脏谷丙转氨酶活力测定实验类型：验证性实验相关知识1. 酶活力：2. 酶活力单位(即酶含量的多少)国际单位 习惯单位：谷丙转氨酶在37度与底物作用30min 后，能产生2.5ug 的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位 3.转氨酶4 谷丙转氨酶一、 实验目的1． 了解转氨酶的性质及临床意义 2． 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理丙氨酸及α－酮戊二酸作用为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。
丙酮酸能与2,4－二硝基苯肼结合，生成丙酸－2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm ，可用于测定丙酮酸的含量。
α－酮戊二酸也能与2,4－二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸－2,4二硝基苯腙的吸光度有差别，在520nm 波长比色时，丙酸－2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。
在520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α－酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以测定谷丙转氨酶的活力。
三、实验器材、试剂、材料 1． 新鲜猪猪脏2． 722型分光光度计、剪刀、吸管3． 标准丙酮酸溶液；谷丙转氨酶底物；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）；0.02%2,4－二硝基苯肼；0.4mol/L NaOH 溶液2 ＋辅基为磷2 2 + + ‘ ‘四、实验操作步聚1.肝匀浆制备（1）将猪肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内（或小研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆。
（每四组1份）（2）吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）（每四组1份）2.谷丙转氨酶活力测定（每组做1份）取试管4支按下表加液五、实验结果与讨论2.每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（谷丙转氨酶活力计算：规定酶在37度与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位）3.每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。
肝脏谷丙转氨酶活力测定
或 组织捣碎机 2. 37℃水浴 3. 分光光度计 4.比色皿
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 2.谷丙转氨酶底物 3.0.1M pH7.4 PB 4.0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液 5.0.4M NaOH 6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
COOH CH 2 2 C O COOH COOH CH 2 CH 2 C H N H2 COOH GPT CH
C H3 CHNH 2 COOH
C H3 C O COOH N O2 H2N H N
2,4-二硝基苯肼
CH 3 C N COOH H2 O N O2 NH
N O2 N O2
丙酮酸二硝基苯腙
3.计算
每ml肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（U/ml） D = （A—B）× 2 S ×2.5 说明：A：样品A 520nm B：对照A 520nm 2：标准丙酮酸浓度 2.5：谷丙转氨酶换算单位
S：标准A 520nm
五、实验步骤
试管 试剂(ml) 谷丙转氨酶底物 肝匀浆 2.4-二硝基苯肼 谷丙转氨酶底物 0.4M NaOH A 520nm 测定管 （A） 0.5 标准管 （S） 0.5 对照管 （B） —— 空白管 —— 0.1（H2O） 0.5 0.5
称取0.5g 肝脏，剪成小块，加入预冷的pH7.4的PBS 4.5ml，在冰水浴中制成 10%的匀浆， 4000rpm冷冻离心10分钟后保存在冰水中备用。
2. 谷丙转氨酶活力的测定
1）取4支试管，标注名称，按照下表操作 2）计算酶活力 本法规定：酶在37℃ 与底物作用30分钟，产生2.5μg 丙酮酸为一个谷丙转 氨酶活性单位。
37℃ 水浴5 分钟 0.1 0.1（标准丙酮酸） 0.1 混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟 0.5 0.5 0.5 —— —— 0.5 混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟 各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm
谷丙转氨酶（ALTGPT）测定程序（赖氏法）
谷丙转氨酶测定程序(赖氏法)一、原理与意义：谷丙转氨酶(ALT/GPT)在37℃及PH7.4条件下，作用于丙氨酸及ɑ-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。
反应30 min后(固定时间)加入2，4－二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即中止反应，同时DNPH与酮酸中羰基加成，生成丙酮酸苯腙。
苯腙在碱性条件下呈红棕色，于505 nm测定吸光值并计算酶活力。
根据ALT活力的高低来反映肝脏细胞损伤的程度。
二、试剂及其配制：1.谷丙转氨酶基质液：4 ℃冰箱保存。
2.2,4-二硝基苯肼(DNPH)液：室温避光保存。
3. 4 mol/LNaOH：用时加蒸馏水稀释至0.4 mol/L，室温保存。
4. 2 mol/ml丙酮酸钠标准液，室温保存。
5.0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，4 ℃冰箱保存。
三、仪器设备：离心机、7 ml离心管、移液器、分光光度计、玻璃比色杯、水浴锅、玻璃棒、冰箱、烧杯、量筒等。
四、操作步骤：1、血清制备：采集全血，室温放置1～2 h，3000 r×15 min离心取上清，待测。
2、血清ALT的测定：表1 血清ALT的测定加样顺序(ml)测定管对照管血清0.1基质液（37 ℃已预热5 min）0.5 0.5混匀后，37 ℃水浴30 min2，4－二硝基苯肼液0.5 0.5血清0.1混匀后，37 ℃水浴20 min0.4 mol/L NaOH 5 5混匀,室温放置5 min，505 nm波长，蒸馏水调零，测各管吸光度，测定管吸光度减去对照管吸光度的差值，查标准曲线，求得相应ALT/GPT活力单位。
五、结果计算与评价表2 标准曲线加样顺序0 1 2 3 4 50.1mol/L磷酸盐缓冲液(ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.102µmol/ml丙酮酸钠标准液(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25谷丙转氨酶基质液(ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.252，4－二硝基苯肼液(ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50混匀后，37 ℃水浴20 min0.4 mol/L NaOH 5 5ALT标准曲线图六、注意事项：1.酶活力超过150单位时，用盐水稀释血清后重测。
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货号: QS1900 规格：50管/24样谷丙转氨酶（GPT）活性测定试剂盒说明书
可见分光光度法
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GPT（EC 2.6.1.2）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化氨基酸和酮酸转氨基反应，在氨基酸代谢中具有重要作用。
此外，哺乳动物肝细胞GPT活性很高，当肝细胞坏死，GPT释放到血液中，血清GPT活性显著增高。
因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
测定原理：
GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸发生转氨基反应，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在碱性条件下呈红棕色，可以在505nm读取吸光值并计算酶活力。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：30mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体5 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体5 mL×1瓶，4℃避光保存；
试剂三：液体50 mL×1瓶，4℃保存；
样品测定的准备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定操作表：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，蒸馏水调零。
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定管需设一个对照管。
计算公式：
1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.4228x+0.0003 (x为标准品浓度，umol/mL；y为Δ
A)。
2、血清（浆）GPT活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0003）÷0.4228÷T×103=118.26×（ΔA-0.0003）
3、细胞、细菌和组织中GPT活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =118.26×（ΔA-0.0003）÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/g鲜重）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =118.26×（ΔA-0.0003）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。
GPT（nmol/min/104cell）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103=0.236×（ΔA-0.0003）
V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，20min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；103：1umol/mL=103 nmol/mL。
1、标准曲线线性范围为：0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、ΔA线性范围为：0.01 -2。
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