细胞爬片步骤
细胞爬片染色步骤
免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。
3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。
阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。
8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤
细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片：1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。
将培养基预热至适宜的温度。
2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。
3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。
4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。
5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。
根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。
固定：1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。
2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。
3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。
免疫荧光：1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。
2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。
3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。
4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。
5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。
6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。
7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。
细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。
这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。
整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。
细胞爬片制作
细胞爬片全过程经验总结细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份漂亮的实验结果的关键步骤。
Easylabs站长根据自已多年的经验，奉献此文，希望对大家的实验有所帮助。
【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。
如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。
烤干后可放入超净台中。
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。
【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
免疫荧光染色-爬片 2
这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：
1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片的六孔板中。
2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。
3）用新鲜配制的2％（或4％）多聚甲醛固定细胞10分钟。
4）PBS洗三遍，每次5分钟。
5）用0.2-0.5％ triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。
6）PBS洗三遍，每次5分钟。
7）2％BSA或者10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS 洗两遍。
8）加入1抗，室温孵育1 小时。
9）PBS洗三遍，每次5分钟。
10）加入二抗，室温孵育30-45 分钟。
11）PBS洗四遍，每次5分钟。
12）加入0.5 ug/ml DAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258）。
13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。
14）加入20 ul封片剂封片。
15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。
注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。
如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的。
如果要做细胞涂片的免疫荧光染色，需用离心涂片机将细胞固定在玻片上，再进行后续步骤。
细胞生物学实验-细胞爬片
二、实验目的
1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料
三、实验材料及设备
1.细胞 CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa
2.试 剂 DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶
3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品： 盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、 试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、 废液缸。
细胞传代（II） -------细胞爬片
2018.10.19
一、实验原理
1.细胞爬片
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在 玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片， 细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也 可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片时， 要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高 压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。
6. 加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上 的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成 细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL）
7. 在35mm培养皿中加入1 mL细胞悬液+1 ml完全培 养基，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及 操作者。
8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养，至下次课 期间换液即可。
9. 整理实验用品。
下次课内容：细胞骨架及细胞核染色 11月2日：期中考试（已学操作，无菌规范）
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养 皿中。
3. 打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉 或吸出培养基。细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。
细胞爬片步骤
细胞爬片步骤PLL配制和处理（Sigma产品，武汉博士德分装，10ml/瓶。
4℃存放，有效期1年）(1) 储存液：1:10稀释液可以保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。
稀释、储存和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。
工作液：0.1%( w/v)PLL，用移液枪吸取0.3ml PLL＋3ml无菌去离子水，混匀放于10ml 无菌塑料离心管中。
封口模密封后4℃存放。
(2) 无菌处理：PLL不可以高温消毒，故应过滤除菌分装于无菌处理的细胞冻存管内，1ml/管，封口模密封，4℃保存。
另外，准备无菌去离子水50ml。
多聚赖氨酸PLL包被（1）灭菌的去离子水(三蒸水)1:10稀释多聚赖氨酸溶液。
（2）用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度维持在18-26℃。
（3）将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。
（注意增加时间不会提高包被效果）。
（4）将过滤除菌的多聚赖氨酸加入一个消毒好的培养皿(超净台内操作)，然后将高压灭菌的小玻片放到多聚赖氨酸内浸泡5min，无菌晾干即可。
（底面贴紧培养皿，存在包被PLL不好的可能，放入培养板孔内注意正反面！！）或者：铺片于培养皿中，移液枪将PLL 工作液滴加于玻片上，室温10分钟后，用消毒好的纱布条吸取玻片上的PLL液。
在超静台内风干后使用，或者超静台内过夜晾干，次日使用。
或者：在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。
步骤：（1）准备24孔细胞培养板（消毒好的培养皿）（2）多聚赖氨酸PLL包被（3）培养板每孔中滴1滴培养基，然后将玻片置于液滴上，压紧（通过表面张力的作用将玻片吸附于培养板上）（4）常规细胞消化，离心，重悬，将吹打的细胞悬液分别加到每个孔盖玻片上，让其贴壁生长，可以用移液枪加样30μl于盖玻片上（5）24孔板做完细胞爬片后，再小心用镊子将爬片取出，细胞面朝向载玻片，用中性树胶封片，照相。
（主张用20%-50%甘油封片，中性树胶封的不好容易“花片”）（6）PBS洗涤，以去除血清等物质。
细胞爬片免疫组化步骤
1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。
（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。
5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。
6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。
8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。
10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
11.显色剂DAB显色。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。
10000-30000左右2.给药处理24h。
3.PBS洗三遍。
4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
（避光）5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
6.5%BSA （牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。
7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。
8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。
10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。
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细胞爬片
细胞爬片
【玻片的准备】
1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；
2．将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者培养皿中烘干后进行高压消毒再烘干。
4.多聚赖氨酸处理玻片，以使细胞与玻片结合更牢。
【细胞爬片】
1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。
4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
【细胞爬片的固定】
1.细胞爬片取出后，一般用PBS洗x2遍，然后再做固定。
2.室温固定15分钟后，弃去固定液，PBS洗3x3min，洗尽液体。
3.将表面液体吹干，入-20℃保存
以下为常用的固定液
（1）. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
（2）. 甲醛(福尔马林)应用最广缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
（3）. 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。
2 / 2
（4）. 95％乙醇，可用于免疫组化。
优点：穿透性强、抗原性保存较好。
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。