微生物检验第九章 细菌的培养与分离技术讲义
细菌分离和鉴定方法PPT讲稿
基过少，划线分离时细菌的营养较少，菌落生长过小，菌落形态不易
观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形态进行观察。
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• 含糖培养基灭菌条件115℃，10～15分钟
• 一般培养基灭菌条件121℃，15～20分钟
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Christain Gram氏创立的，用于细菌分类学研究。 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
• 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏
阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。
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革兰氏染色法基本原理
• 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性
透明度：透明、半透明、不透明。
嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有 特殊芳香气味。
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氧化酶试验
原理
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终
末呼吸酶，系由细胞色素a和a3所组成，一般仅存于需氧菌和兼性
厌氧菌中，它使细菌能利用氧作为氢的最终受体，使分子氧还原为 过氧化氢，过氧化氢的积累会有毒性，固本试验的阳性菌，不仅需 氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并不是直接与试剂起反应，而是
且细菌为蛋白质，被热凝固后可保持完整形态。 • 固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
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革兰氏染色法
染色：初染 → 媒染 → 脱色 → 复染 • 初染：加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1～2分钟，水洗。 • 媒染：滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1分钟，水洗。 • 脱色：加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复2～3次（约30秒）。水
《细菌的培养与分离》课件
细菌培养的重要性
细菌培养是研究微生物的基础实验之一，通过细菌培养可以 了解微生物的生理生化特性、代谢途径、遗传特征等，为微 生物资源的开发利用提供基础数据。
细菌培养在医学、农业、工业等领域具有广泛的应用价值， 例如在医学上用于病原菌的分离、鉴定和药敏试验，在农业 上用于土壤微生物的调查和生物防治等。
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细菌培养技术
液体培养基培养
液体培养基是一种均匀的、呈 液态的培养基，适合细菌的生 长繁殖。
液体培养基通常含有必要的营 养物质，如碳源、氮源、水、 无机盐等，以支持细菌的生长 。
在液体培养基中，细菌可以自 由悬浮，并且生长速度较快， 适用于大规模工业生产。
固体培养基培养
固体培养基是一种呈固态的培养 基，适合细菌的分离和纯化。
固体培养基通常含有琼脂等凝固 剂，将培养基凝固成固体状态。
在固体培养基上，细菌可以形成 可见的菌落，通过菌落的特征可
以对细菌进行鉴别和分类。
特殊培养基培养
特殊培养基是根据特定细菌的特殊需求而设计的培养基。
特殊培养基可以提供特殊的营养物质、生长因子或环境条件，以支持特定细菌的生 长。
特殊培养基在研究细菌的生理特性、致病机制等方面具有重要作用。
在食品工业中，细菌培养 与分离用于检测食品中的 病原菌，保证食品的安全 性和卫生质量。
生物能源
通过培养和分离厌氧菌， 可以生产生物沼气等可再 生能源，满足能源需求并 减少对化石燃料的依赖。
生物制药
通过培养和分离微生物， 可以生产各种生物药物， 如抗生素、酶制剂等。
在环保领域的应用
微生物学检验细菌的培养与分离技术PPT课件
灭菌
★ 不耐高温的液体成分：滤过除菌
检定 保存
培养基pH测定及矫正
材料： 待测培养基、 pH7.4标准比色管、4孔比色架、0.02％酚红、 氢氧化钠0.1mol/L、1mol/L） 盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 蒸馏水 试管（与比色管口径一致）、 刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、
玻璃器皿灭菌前的准备
玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的 包裹和加塞后才能进行灭菌处理。
培养基的成分和作用
培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的 综合营养基质。 营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、 血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂
培养基的种类（按用途分类）
培养基液面为黄色： － 应用：用于肠道杆菌的鉴定
靛基质试验原理
色氨酸
色氨酸酶
靛基质 （吲哚）
对二甲基氨基苯甲 醛 玫瑰靛基质 （玫瑰吲哚）
硫化氢试验
原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸， 生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐 或铅盐结合生成黑色络合物。 培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基 结果：培养基 变黑 为阳性，不变黑为阴 性 应用：常用于肠道杆菌的鉴定
液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数
分区划线法
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
细菌培养法
一般培养（需氧培养）： ★培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ★培养时间：18～24h
二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培 养箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌 氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
细菌的分离培养与鉴定PPT课件
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硫化氢产生试验(Production of H2S)
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中， 37℃培养24h后观察结果。有些细菌能分解 培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺 部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色 无变化，则为阴性。
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尿素分解试验(Splitting of urea)
➢ 相邻两区要有重叠区域。 ➢ 结果观察：观察各区的生长情况，并看是
否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、 大小、边缘、透明度都需记录。
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平皿送37℃温箱培养24小时 结果(要求)
两种单个菌 落
分四区 无杂菌 琼脂不破
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℃
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3.2 细菌的接种
斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。
将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养 18～24h。变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素 产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色， 是为阳性反应。
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实验后处理
将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！ 将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架
中ห้องสมุดไป่ตู้ 将自己接种的培养物集中在试管架中统一放
入培养箱中37度培养！ 关照明和电扇开关，请勿关实验室总电
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糖发酵试验
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。 例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾 杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使 两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽 相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄 糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2， 故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵 葡萄糖仅产酸不产气。
2017年初级检验技师《微生物检验》讲义第9章细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术一、基本条件（一）细菌实验室细菌实验室是进行细菌学实验的场所，标本的接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。
所以细菌实验室应该符合一定的条件。
应执行中华人民共和国卫行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。
对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
7.细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具包括温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜、高压蒸气灭菌器、干烤箱、冰箱和冷藏柜、接种环和接种针、pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
二、细菌的接种与分离技术为了从临床标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，除选择好合适的培养基外，还要根据待检标本的来源、培养目的及所使用培养基的性状，采用不同的接种方法。
临床检验技师-微生物检验(2019)讲义第九章_细菌的培养与分离技术
第九章细菌的培养与分离技术本章内容一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查基本条件（一）细菌实验室：生物安全柜。
（二）无菌实验室（三）基本设备和器具：温箱、 CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸汽灭菌器、干烤箱；接种环和接种针；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的接种与分离技术平板划线分离法：分散生长，各自形成菌落。
连续划线法：杂菌不多。
分区划线法：杂菌多。
斜面接种法：单个菌落纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
液体接种法：多用于一些液体生化试验管的接种。
穿刺接种法：半固体培养基，接种针。
倾注平板法：测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。
将标本适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，再倾入已溶化并冷却至 45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
涂布接种法：常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
细菌的培养方法培养条件：根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选用不同环境条件进行培养。
细菌的生长现象分离培养基上菌落的生长现象观察菌落的大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度等。
血琼脂上的溶血：α溶血：菌落周围出现绿色环状，红细胞外形完整无缺。
β溶血：菌落周围形成一个完全清晰透明的环，红细胞溶解。
γ溶血：没有溶血，红细胞无溶解。
双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。
气味液体培养基中的生长现象肉汤培养基的混浊度、沉淀、菌膜，气味和色素等。
细菌数量达106～ 107CFU/ml，培养肉汤才见混浊。
血液培养的检查和传代培养：肉眼观察其生长现象，如溶血、产生气体或混浊度等。
半固体培养基中细菌的动力有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见混浊或细菌生长的小菌落。
细菌 L 型的检查1.标本采集：无杂菌污染的组织或体液标本应加 20%蔗糖无菌溶液保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。
微生物检验学之细菌的培养与分离技能技术总结
精心整理细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查一、基本条件（一）细菌实验室1.2.3. 4. 5.菌处理。
6.7. 1. 2. 3.4. 5. pH二、细菌的接种与分离技术（一）平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。
常用的平板划线分离法有以下两种： 1.连续划线分离法杂菌不多的标本。
2.分区划线分离法杂菌量较多的标本。
（二）斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
（三）液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。
（四）穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。
（五）倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。
（六）涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。
常用的有需氧培养法、二氧化碳培培养瓶置35℃6～18h后，用肉眼观察其生长现象，如：溶血、产生气体或混浊度等。
应每天肉眼检查细菌生长情况，若为生长阳性应做进一步的分离鉴定和药敏；若为生长阴性，应孵至第7天弃去。
有些细菌如奈瑟菌属和嗜血杆菌属的菌株，心杆菌属、放线杆菌属的细菌都需要较长时间培养。
血培养孵育24h后，肉眼观察阴性的血培养瓶，一般不需做常规显微镜检查，因培养物中有105菌落形成单位CFU/ml，才能通过革兰染色检出细菌。
（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。
五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。
细菌的分离、培养和鉴定PPT课件
二）仪器的自动化鉴定：VITEK 系统、M IDI系统、 BIOLOG 系统、SENS ITITRE 系统、 AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCAN系统等 （ATB Expression）
三）分子生物学方法:基因测序、指纹图谱技术、基
因探针技术、聚合酶链反应( PCR)、GC 含量测定
等
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PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成 比较经典的核酸检测技术, 目前这两者已经 得到了较大范围的推广和应用
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微生物学工作必须在一个清洁卫生的环 境中进行，实验室的整洁与否直接影响 实验效果。在卫生状况差而零乱的实验 室中不可能取得好的实验效果；实验室 脏、乱，不但增加了污染的机会，同时 也影响人的安全和情绪，所以，清洁、 明亮的实验环境是顺利开展工作的保障 之一；保持实验室清洁是学生进入实验 应尽的责任。
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上反应；
从而达到区分不同的微生物精品。ppt （TCBS）
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❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
细菌的分离、培养与鉴定
王欣欣
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1
一、细菌的分离
1、从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 方法称为分离。 2、分离的目的在于从被检材料中、或者从 污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
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2
1)病料采集
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第九章细菌的培养与分离技术
本章内容
一、基本条件
二、细菌的接种与分离技术
三、细菌培养的方法
四、细菌的生长现象
五、细菌L型的检查
基本条件
（一）细菌实验室：生物安全柜。
（二）无菌实验室
（三）基本设备和器具：温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸汽灭菌器、干烤箱；接种环和接种针；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的接种与分离技术
平板划线分离法：分散生长，各自形成菌落。
连续划线法：杂菌不多。
分区划线法：杂菌多。
斜面接种法：单个菌落纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
液体接种法：多用于一些液体生化试验管的接种。
穿刺接种法：半固体培养基，接种针。
倾注平板法：测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。
将标本适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，再倾入已溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
涂布接种法：常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
细菌的培养方法
培养条件：根据临床初步诊断及待检细菌的种类，选用不同环境条件进行培养。
细菌的生长现象
分离培养基上菌落的生长现象
观察菌落的大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度等。
血琼脂上的溶血：
α溶血：菌落周围出现绿色环状，红细胞外形完整无缺。
β溶血：菌落周围形成一个完全清晰透明的环，红细胞溶解。
γ溶血：没有溶血，红细胞无溶解。
双环：菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。
气味
液体培养基中的生长现象
肉汤培养基的混浊度、沉淀、菌膜，气味和色素等。
细菌数量达106～107CFU/ml，培养肉汤才见混浊。
血液培养的检查和传代培养：肉眼观察其生长现象，如溶血、产生气体或混浊度等。
半固体培养基中细菌的动力
有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见混浊或细菌生长的小菌落。
细菌L型的检查
1.标本采集：无杂菌污染的组织或体液标本应加20%蔗糖无菌溶液保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。
2.分离培养：标本接种到高渗肉汤增菌培养1～7d，然后转种L型平板和血平板37℃培养2～7d。
3.生长现象：常有油煎蛋样菌落（典型L型菌落）、颗粒型菌落（G型）和丝状菌落（F型）三种类型。
平板分区划线的目的
A.使细菌获得充分的营养
B.减少细菌间的相互抑制
C.获得足够的单个菌落
D.利于细菌的大量生长
E.加快细菌的生长速度
『正确答案』C
『答案解析』平板划线分离法：分散生长，各自形成菌落。
连续划线法：杂菌不多。
分区划线法：杂菌多。
在临床细菌学检验中，含菌量较多的标本如粪便，接种方法适宜用
A.平板倾注培养法
B.平板连续划线法
C.平板分区划线法
D.斜面接种法
E.半固体穿刺接种法
『正确答案』C
『答案解析』对于含菌量较多的标本适宜用平板分区划线法。
关于倾注平板法，错误的是
A.可用于尿液、牛乳等标本的计数
B.所用培养基预先灭菌后溶化
C.先取一定量标本加入无菌平皿内，再加入培养基混匀
D.先取一定量标本与培养基混匀后，再倒入无菌平皿内
E.培养基温度以45℃左右为宜
『正确答案』D
『答案解析』倾注平板法应先取一定量标本加入无菌平皿内，再加入培养基混匀。
不属于细菌形态学观察的是
A.平板分区划线观察单个菌落
B.革兰染色观察细菌染色性
C.鞭毛染色观察细菌的动力
D.光镜观察细菌
E.暗视野显微镜观察细菌动力
『正确答案』A
『答案解析』平板分区划线观察单个菌落属于细菌生长现象，不是细菌形态学。
平板划线分离细菌成功的标志是
A.Ⅰ区和Ⅱ区不相连
B.有明显的三区划线
C.培养出单个菌落
D.不能划破培养基
E.不能有污染菌生长
『正确答案』C
『答案解析』平板划线分离细菌成功的标志是培养出单个菌落。
观察细菌动力最常使用
A.液体培养基
B.半固体培养基
C.固体平板培养基
D.固体斜面培养基
E.厌氧培养基
『正确答案』B
『答案解析』观察细菌动力最常使用半固体培养基。