核酸印讲义迹与分子杂交 PPT课件
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核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
核酸分子杂交ppt课件
核酸分子杂交
一、概念：
1、分子杂交（hybridizat子浓度等条件下，通过碱基 互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体 支持物上的过程。
3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物 素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特 异性互补的已知DNA或RNA片段。
(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中 转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。 被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。
二、Southern杂交
1、步骤：
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后 的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下 列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使 DNA原位变性。
进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到 一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一 张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂 解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
五、斑点杂交
（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。
后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正 电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获 得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可 促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形 成交联结构,而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价 结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
三、Northern杂交
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别 是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去 除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有2种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将 RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
一、概念：
1、分子杂交（hybridizat子浓度等条件下，通过碱基 互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
2、 印迹（bloting）：将DNA、RNA或蛋白质固定到固体 支持物上的过程。
3、探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物 素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特 异性互补的已知DNA或RNA片段。
(2) Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中 转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。 被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。
二、Southern杂交
1、步骤：
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后 的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下 列步骤:
(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使 DNA原位变性。
进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到 一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一 张尼龙膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂 解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
五、斑点杂交
（2）254nm波长的紫外线照射尼龙膜带RNA的一面。
后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正 电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获 得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可 促进DNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形 成交联结构,而过度照射却使DNA上一部分胸腺嘧啶共价 结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。
三、Northern杂交
Northern杂交与Southern杂交很相似。主要区别 是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去 除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有2种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳。 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern转移相同的方法将 RNA转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
核酸的分子杂交1310PPT课件
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重物 支持平台
玻璃板
吸水纸
湿滤纸 膜 胶 湿滤纸 湿滤纸桥
20×SSC
毛细管虹吸法Southern转膜示意图
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玻璃容器 24
5. 探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法
制备探针、标记。
6. Southern杂交
（1） 预杂交 封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4～6小时
⑵ 液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放
在液体中进行杂交反应。
两种杂交形式的基本原理都是一样的。
从发展历史来看,先有液相杂交,后有固—液相杂交.
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13
四、核酸分子杂交的过程—DNA的变性与复性
1.变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸
碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断
裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、
如尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核
酸分子。
除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主
要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而
AT含量高的DNA容易变性。另外,环状DNA比线性DNA难于变性.
.
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2.复性
DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分
（2） 杂交 （过夜）
7. 杂交结果的检测
（1） 放射线标记——放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；
（2） 非放射线标记——直接显出杂交带，进行检测。
.
25
②
③ ①
分子杂交实验过程 .
目录
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பைடு நூலகம் 射 自 显 影 照 片
DNA印迹与杂交技术PPT课件
23
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
47
3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
48
4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
52
（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
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6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
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4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的 DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器 中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤 纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动 凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上。
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3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂
交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进
行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度
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4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交
液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 35~42 ℃杂交
的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分
子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉。
51
五、 其它分子杂交方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
固相杂交
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（一）Northern印迹杂交
30
5、Southern杂交
1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液
2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA
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6. 杂交结果的检测
化学显色或放射自显影
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[课件]核酸分子杂交与应用PPT
![[课件]核酸分子杂交与应用PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/1956ac56f46527d3240ce0db.png)
2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
6
2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
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核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
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2018/12/6
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
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2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
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3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
核酸印迹与分子杂交
95℃DNA模板变性成为单链，引物自身和
引物间的局部双链消除
• 退火(Annealing)
引物与模板DNA杂交，Tm值减5℃ • 延伸(Extension) DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成
PCR技术的工作原理
ing
PCR技术
• PCR分析已知基因；
• 反转录PCR（reverse transcription PCR， RT-PCR）是将RNA的反转录和PCR联合应用 的一种技术。 RT-PCR是从组织或细胞中获得目的基因 及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析 的有效方法。
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RT-PCR与PCR区别
• 模板为mRNA
•
•
需逆转录酶
产物为cDNA
反转录合成cDNA
mRNA mRNA
5 oligo(dT)12-18 5 反转录酶 AAAAAA(n) 3 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 3 RNase H TTTTTT(n) 5 DNA 聚合酶 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 S1 核酸酶 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5
分子生物学技术
高 颖
gaoying822@
核酸印迹技术与分子杂交
Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization
核酸分子杂交
（nucleotide molecular hybridization） –以DNA的变性、复性为理论基础； –指具有一定同源序列的两条核酸单链 （DNA或RNA），在一定条件下按碱基互 补配对原则经过复性处理后，形成异源 双链的过程。
Southern印迹（Southern blot）
《核酸的分子杂交》PPT课件
亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
精选课件ppt
Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
精选课件ppt
2
精选课件ppt
3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
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21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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《核酸分子杂交》课件
实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。