化脓隐秘杆菌毒力因子的研究进展

化脓隐秘杆菌毒力因子的研究进展郭文洁,赵敬翠,刘耀川,朱竟赫,刘明春(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161)中图分类号:S852.61 文献标识码:A 文章编号:052926005(2010)0120052202 化脓隐秘杆菌(A rcanobacterium pyogenes)又名化脓放线菌或化脓棒状杆菌,为革兰染色阳性的短棒状杆菌,普遍存在于牛、羊、猪和其他重要经济动物的黏膜上[1],是一种条件性致病菌。

化脓隐秘杆菌可在家畜间广泛传播,导致广泛多样的皮肤、内脏器官和关节的非特异性化脓性感染,如急性化脓性乳房炎、慢性脓肿性乳房炎、关节炎、心内膜炎、肝脓肿、子宫炎以及流产和不孕等,给养殖业带来较大的经济损失。

目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子有4类,分别为化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)、胶原结合蛋白(CbpA)、神经氨酸酶(Nan)及菌毛合成蛋白(Fim)。

以下分别对各类毒力因子的研究现状做一综述,期望对化脓隐秘杆菌引起的感染性疾病的防治有所帮助。

1　化脓隐秘杆菌的毒力因子1.1　溶血素　化脓隐秘杆菌能产生一种溶血素(Pyol ysi n)即PLO,分子量为57.9kDa,由plo基因编码。

plo基因含1605个碱基。

若plo基因发生插入失活,将导致PLO的溶血活性丧失。

化脓隐秘杆菌溶血素是一种外毒素,能够溶解多种动物的红细胞、免疫细胞,并引起试验动物的皮肤坏死以及动物的死亡。

PLO还呈现出对牛多形核粒细胞和袋鼠肾细胞的细胞毒性效应。

PLO被认为具有氧化稳定性,并且具有胆固醇依赖性。

由于在自然感染和人工感染动物的血浆中都发现了抗溶血素抗体,说明它能够在活体内表达并具有免疫原性。

Billington S J等[2]于1997年研究发现,假设组织产生单独的溶血素,重组PLO的未纯化特异性抗体能完全中和化脓隐秘杆菌的溶血活性;此外,这些抗体还能够被动地保护小鼠防御化脓隐秘杆菌的致命性攻击。

Jo st B H等[3]于1999年应用经甲醛灭活的重组体PLO对小鼠进行预防接种,发现其可保护小鼠免受腹膜内化脓隐秘杆菌的攻击;并于2003年发现了3种类毒素即H IS2PLO.F(497)、收稿日期:2009201212基金项目:国家自然科学基金(30972214);辽宁省自然科学基金(20082126);辽宁省教育厅科学研究计划(2008641)作者简介:郭文洁(19832),女,硕士生,研究方向为兽医药理学与毒理学,E2mail:gwj0825@通讯作者:刘明春,E2mail:liumingchun@ HIS2PLO.Delta P(499)和HIS2PLO.A(522),均可用于小鼠的被动免疫,且这3种物质不具有溶血活性,因此无需灭活,进而实现了对化脓隐秘杆菌病的免疫预防[4]。

研究还发现PLO是巯基活化溶细胞素家族的成员,其结构有30%～40%与许多革兰阳性菌产生的巯基活化溶血素相同。

但PLO与高度保守的巯基活化溶细胞素有所不同,特别是巯基活化必需的半胱氨酸残基被丙氨酸所取代。

在诱变作用方面, PLO中的丙氨酸残基与半胱氨酸残基相比不具有巯基活化作用,进而导致毒素局部构象的差异。

1.2　胶原结合蛋白　胶原结合蛋白(collagen2 binding protein,CbpA)是在化脓隐秘杆菌中发现的第一种粘附素,它是一种蛋白,存在于细菌表面。

Paula A E等[5]研究发现化脓隐秘杆菌的神经氨酸酶缺乏型突变体只是减少了对宿主细胞的粘附,并没有丧失粘附活性,进而应用Far Western blotting方法研究发现了CbpA蛋白。

编码CbpA的基因为cbpA,含有3500个碱基,表达产物为124.7kDa。

经克隆和序列分析证实CbpA为典型的细胞表面粘附素家族成员。

CbpA蛋白包含有一个N2末端的配体结合区域(即A区域)和一个C2末端的重复区域(即B区域)。

CbpA的主要作用是连接胶原蛋白,促进细菌对宿主细胞的粘附,从而增强细菌的侵袭力,提高其毒力作用。

6个组氨酸标记的重组体CbpA(HIS2 CbpA)能够与I、II和IV型胶原蛋白结合,但不表现纤维蛋白连接活性。

另外,CbpA还可促进化脓隐秘杆菌与HeLa细胞株、3T6细胞系的粘附,敲除cbpA基因后其粘附力分别为原来的38.2%和57.0%。

HIS2CbpA对化脓隐秘杆菌粘附性的调节具有剂量依赖性,且cbpA基因仅存在于48%的化脓隐秘杆菌中。

因此,CbpA虽然对化脓隐秘杆菌的粘附性产生一定的影响,但并不如神经氨酸酶强[5]。

最新研究表明,抗Cbp A的抗体能够有效抑制CbpA的聚集及其对胶原蛋白的粘附[6]。

1.3　神经氨酸酶　目前,在化脓隐秘杆菌中发现的神经氨酸酶(neuraminidase,Nan)有两种,即Nan H 和NanP,分别由nan H和nan P编码。

Nan具有多种毒力作用,能够分解宿主细胞的唾液酸作为碳源,促进其在低养分条件下的生长;降低膜表面黏液的25中国兽医杂志2010年(第46卷)第1期 Chinese Journal of Veterinary Medicine 粘滞性,便于细菌潜入深层组织;可分解蛋白质如IgA,与宿主防御反应有关;能够增强细菌对宿主的粘附力、聚集力和感染力。

nan H基因含有3009个碱基,编码107kDa的Nan H蛋白。

Nan H与多种细菌产生的Nan表现出相似性。

Nan H只存在于化脓隐秘杆菌的细胞壁。

nan H基因的插入缺失将导致Nan的活性降低,但并不会失活。

这说明化脓隐秘杆菌还可能产生另外一种Nan。

nan P基因由nan H基因产生的突变体形成,含有5112个碱基,编码的NanP为186.8 kDa。

化脓隐秘杆菌BBR1中nan P基因的插入缺失导致Nan的活性降低,但并不会失活;而如果是nan H基因的突变株发生nan P基因的插入缺失,则将导致Nan活性完全丧失。

与Nan H一样,NanP 也存在于化脓隐秘杆菌的细胞壁;但二者不同的是在所有的菌株中均可检测到Nan H,而NanP只在64.2%的菌株中检测到[7]。

1.4　菌毛合成蛋白　对各种菌毛合成蛋白具体功能的研究,以大肠杆菌最为详尽。

而有关化脓隐秘杆菌菌毛的报道较少,仅见近期报道发现了4种参与菌毛合成的蛋白,分别为FimA、FimC、FimE和Fim G。

这4种蛋白分别由f im A、f i m C、f i m E和f i m G基因编码。

研究发现,几乎所有菌株都表达f i mA基因,f i m E基因存在于98%的菌株中,而f i m C和f im G基因仅存在于67%的菌株中[8]。

但对各种蛋白具体作用机理的研究还不深入,仅知其在细菌粘附中起着重要的作用。

1.5　其他毒力因子　在对化脓隐秘杆菌致病机理的研究中发现,除上述4类毒力因子外,可能还存在其他毒力因子,并且可能与其致病力有关[9]。

如纤维蛋白原结合蛋白(fibrinogen2binding protein)能够与纤维蛋白原结合,并且通过与多形核嗜中性白细胞(PMNs)相互作用促进吞噬;纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin2bind2 ing protein)能够与纤连蛋白结合,促进粘连。

另外,化脓隐秘杆菌还可能分泌多种酶,来分解宿主细胞为其自身提供养分:(1)DNA酶,可分解宿主核苷酸,使之成为自身的营养物质。

(2)蛋白酶(Proteases),可分解宿主蛋白质,释放氨基酸作为营养物质;可分解蛋白质如Ig A,与宿主防御反应有关。

但对这几种毒力因子的研究还不深入,其编码基因以及具体作用还有待进一步研究和确定。

2　影响化脓隐秘杆菌毒力因子作用的因素Silva E等[8]应用BOX2PCR技术,对分离自正常产母牛和患临床型子宫炎母牛的化脓隐秘杆菌进行了基因鉴定,研究影响疾病发生发展的因素,并且对化脓隐秘杆菌产生的四大类8种毒力因子(PLO、CbpA、Nan H、NanP、FimA、FimC、FimE、Fim G)进行了筛选。

结果表明,在正常产母牛和患子宫炎母牛体内分离到的化脓隐秘杆菌中,8种毒力因子的检出情况无明显差异,这提示我们毒力因子在各菌株中的存在与否,不一定是该菌引起临床型子宫炎的决定因素。

由此可见,各种毒力因子基因的存在与否、种类如何并不能直接决定化脓隐秘杆菌的毒力,而其致病力要受到宿主的内在因素、与其他病原菌的协同作用以及各种毒力因子的差异性表达等多种因素的影响。

正是这些因素的共同作用决定了化脓隐秘杆菌的致病力。

3　小结目前对化脓隐秘杆菌毒力因子的研究还不很全面,对某些已发现的毒力因子的作用机理的阐述也还不够明确。

例如菌毛合成蛋白的研究还刚刚处于起步阶段;已经发现了结合胶原蛋白的CbpA,但是否存在结合纤维蛋白的结构等还有待于进一步研究。

此外,研究还发现化脓隐秘杆菌具有侵入上皮细胞和在巨噬细胞内存活的能力,但其机理还未阐明[9],以及生物被膜的形成在其感染过程中的作用等都有待于进一步研究。

对化脓隐秘杆菌毒力因子的深入研究,必将为化脓隐秘杆菌引起的感染性疾病的防治提供理论依据。

参考文献:[1]　Queen C,Ward A C S,Hunter D L.Bacteria isolated fromnasal and tonsillar samples of clinically healthy Rocky Mountain bighorn and domestic sheep[J].Wildl Dis,1994,30(1):127. [2]　Billington S J,Jost B H,Cuevas W A,et al.The A rcanobac2teri um(A ctinom yces)p yogenes hemolysin,pyolysin,is a no2 vel member of t he t hiolactivated cytolysin family[J].Bacteri2 ol,1997,179(19):610026106.[3]　Jost B H,Songer J G,Billington S J.An A rcanobacteri um(A ctinom yces)p yogenes mutant deficient in production of t hepore2forming cytolysin pyolysin has reduced virulence[J].In2 fect Immun,1999,67(4):172321728.[4]　Jost B H,Trinh H T,Songer J G,et al.Immunization wit hgenetic toxoids of t he A rcanobacteri um p yogenes cholesterol2 dependent cytolysin,pyolysin,protect s mice against infection [J].Infect Immun,2003,71(5):296622969.[5]　Paula A E,Billington S J,Malen A L,et al.The A rcanobac2teri um p yogenes Collagen2Binding Protein,CbpA,Promotes Adhesion to Host Cells[J].Infect Immun,2003,71(8): 436824374.[6]　Pietrocola G,Valtulina V,Rindi S,et al.Functional andstructural properties of CbpA,a collagen2binding protein fromA rcanobacteri um p yogenes[J].Microbiology,2007,153(10):338023389.[7]　Jost B H,Songer J G,Billington S J.Identification of a secondA rcanobacteri um p yogenes neuraminidase and involvement ofneuraminidase activity in host cell adhesion[J].Infect Immun, 2002,70(3):110621112.[8]　Silva E,Gaiv o M,Leit o S,et al.Genomic characterizationof A rcanobacteri um p yogenes isolates recovered from t he ute2 rus of dairy cows wit h normal puerperium or clinical metritis [J].Vet Microbiol,2008,132(122):1112118.[9]　Jost B H,Billington S J.A rcanobacteri um p yogenes:molecu2lar pat hogenesis of an animal opportunist[J].Antonie van Leeuwenhoek,2005,88(2):872102.35 Chinese Journal of Veterinary Medicine 中国兽医杂志2010年(第46卷)第1期。