第二章 发酵液的预处理和固液分离

N：阿伏伽德罗常数，mol-1；
e：电子电荷，库仑； k：波尔兹曼常数，J· K-1； T：热力学温度，K； ci：i离子摩尔浓度，mol/L； Zi：i离子的化合价。
从上两式可知，ξ电位与溶液 中带相反电荷的离子强度有关， 因此，提高离子的化合价和浓度 可以压缩扩散双电层，使其厚度 减小，从而使ξ电位降低。
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预处理的方法

凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation 加热法 Heating 调节悬浮液的PH值 Regulation of PH 杂蛋白的去处 Removal of useless protein 高价无机离子的去处 Removal of inorganic ion 助滤剂Filter aids和反应剂 Reactant
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Schulze－Hardy法则：反离子的价数越高，凝 聚价越小，即凝聚能力越强。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力受化合价、 水化半径、离子运动能力的影响，次序为
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
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常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
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路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
精制( 结晶、干燥 结晶、干燥 )
第二章 发酵液的预处理和 固液分离
第一讲
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预处理和固液分离内容
提取生化物质的第一步，分两部分： 发酵液
胞外 上清液/滤液
预处理
固液分离
胞内 富集细胞
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发酵液成分很复杂，包含菌（细胞）体，胞内 外代谢产物，及剩余的培养基残分等。 不管人们所需要的产物是胞内还是胞外，都首 先要进行培养液的预处理和固液分离开，才能 进行后续操作： 对于胞内产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去 处，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。 对于胞外产物，首先富集菌体，再进行细胞破 碎和碎片分离，然后提取胞内产物。
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预处理的目的
预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度， 提高固液分离的效率：



⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒 子的尺寸，降低液体黏度。 ⑵ 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离 子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。 ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液 相）；
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目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用 于食品和医药工业时应谨慎。
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2）天然有机高分子絮凝剂
人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在 着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受 到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物 降解，原料来源广等优点。
天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可 分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。 其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引人注目。

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3）无机高分子聚合物
有聚合铁系和铝系两大类 铁系絮凝剂具有操作简单、费用低，受温度影 响小，亲和力强，能有效地去除悬浮物、表面 活性剂、破坏油水乳状液的能力很强等优点， 缺点腐蚀性强、稳定性差。 铝系是目前应用广、工艺较成熟的一类无机金 属盐絮凝剂，絮凝效果好，缺点具毒性等。


凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类） 作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm 大 小块状凝聚体的过程。 絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子 量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成 10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起 架桥作用。
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（一） 凝 聚 Coagulation
凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成 大粒子（1mm）
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微生物絮凝剂
1、微生物絮凝剂的商业化生产始于20世纪90年代，
如红平红球菌及由此制成的NOC-1是目前发现的最佳微生物 絮凝剂
2、微生物絮凝剂或将大部分替代普通絮凝剂
3、浮游藻类、草分枝杆茵、硅酸盐芽孢杆菌。
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絮凝的影响因素



发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）； 絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖； 絮凝剂的分子量； pH 控制； 搅拌速度。
加热法注意事项：
使用加热法时必须严格控制加热 温度与时间。
1. 加热的温度必须控制在不影响目的产物活 性变质的范围内； 2. 温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞 内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响 其后的产物分离与纯化。
三 预处理-调节pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调 节pH值可改善其过滤特性。
当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间 的范德华引力时，由于热运动的结果就导 致胶粒的互相碰撞而聚集。 另外，由于电解质离子在水中的水化 作用会破坏胶粒周围的水化层，使胶粒可 以直接碰撞而聚集。
影响凝聚作用的主要因素是无机盐的种类、 化合价以及无机盐的用量。 根据静电学基本定理，可推导ξ电位的基 本公式为 4q
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（二）絮 凝

flocculation
絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联 成网状，形成絮凝团的过程 机理：架桥作用 采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发 酵液较易分离。
来自百度文库
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絮凝
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分 子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其 链节上含有许多活性官能团，包括离子基团以及非 离子型基团。 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强 烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的 胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团， 产生絮凝作用。
凝聚价或凝聚值


在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能 脱除胶粒表面的水化膜，降低ζ电位，使双电 层的排斥力减少，当不足以抗衡胶粒间的范德 华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相 碰撞而聚集起来。 电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示， 使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩 尔／升），称为凝聚价或凝聚值。
机理： 1）中和粒子表面电荷 2）消除双电层结构 3）破坏水化膜
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胶体双电层结构
• 发酵液中菌体表面带有负 电荷，由于静电引力使溶 液中反离子被吸附在其周 围，在界面上形成了双电 层。 • 正离子同时受到使它们均 匀分布的热运动影响，具 有离开胶粒表面的趋势。
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双电层的组成
在相距胶核表面约一个离子半径Stern平面以内， 正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层；
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高分子絮凝剂的吸附架桥作用
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对絮凝剂的化学结构一般有下列要求: 分子必须含有相当多的活性官能团，使之 能和胶粒表面相结合； 必须具有长链的线性结构，以便同时与多 个胶粒吸附形成较大的絮团，但絮凝剂的 相对分子量不能超过一定限度，以使其具 有良好的溶解性。
根据其活性基团在水中解离情况 的不同，絮凝剂可分为:
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微生物絮凝剂




微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂， 一类由微生物或其分泌物产生的具有絮凝细胞功能 的代谢产物。 包括直接利用微生物细胞的絮凝剂、利用微生物细 胞壁代谢产物的絮凝剂和克隆技术所获得的絮凝剂 主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸等高分 子物质。 微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化学合成的絮凝剂相 比，最大的优点是安全，无毒和不污染环境。

D
（ 2－ 1 ）
q：胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密 度，库仑/m2；
D：水的介电常数，F· m-1； δ：扩散层的有效厚度，m（即吸附层和扩散层 界面处电位Φd降低到其值为1/e处的距离，不能直 接测定）
1000 D k T 4Ne
1 2 c Z i i （2-2)
胶粒保持分散状态的原因
带有相同电荷和扩散双电层的结构。 ξ电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分 散程度也越大，发酵液过滤就越困难。 胶粒表面的水化作用，形成了包围 于粒子周围的水化层，也能阻碍胶粒间的 直接聚集。
如果在发酵液中加入具有相反电性的 电解质，就可以中和胶粒的电性，使ξ电 位降低，胶体体系变得不稳定。



固液分离方法主要是过滤和离心。 对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度 大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。 发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。 因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速 率与液体的粘度成反比，降低液体粘度就可 有效提高过滤速率。
降低液体粘度的常用方法 加水稀释法 加热法
加水稀释法
优点：降低液体粘度
缺点：增加悬浮液的体积，加大 后继过程的处理任务。
加热法
优点：1. 升高温度可有效降低液体粘度，提高 过滤速率； 2. 在适当温度和受热时间下可使蛋白质 凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进 一步改善了发酵液的过滤特性。 实例：链霉素发酵液，调酸至pH3.0后，加热至 70℃，维持半小时，液相粘度下降至原 来的1/6，过滤速率可增大10～100倍。
细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮
凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。 调节发酵液的pH到蛋白质的等电点是除去蛋白质的有效 方法。大幅度改变pH还能使蛋白质变性凝固。 通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可 减少膜堵塞和污染； 影响离子型絮凝剂的电离度。
在Stern平面以外，剩余的正离子在溶液中扩散 开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的 平均浓度，称为扩散层。
当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液 体，随着它一起滑移，这一薄层的厚度比吸附层 稍大，滑移面在图中用波纹线表示。 滑移面上的电位称为ξ电位（或电动电位）， 它是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双 电层的特征，是研究凝聚机理的重要参数。
生物产品生产过程示意图
生物催化剂 空气 除菌 提取纯化 产品 废弃物 检测 控制系统 副产品
生物反应器
灭菌
原材料 机械能、热能
本门课程解决的问题
1
生物分离过程的一般流程
原料液 原料液 细胞分离 ( 细胞分离 ( 离心，过滤 离心，过滤 )) 细胞－胞内产物 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲 加盐酸胍、脲 ) 复性 细胞破碎 碎片分离 碎片分离 粗分离( 盐析、萃取、超过滤等 盐析、萃取、超过滤等 ) 纯化( 层析、电泳 层析、电泳 ) 脱盐( 凝胶过滤、超过滤 凝胶过滤、超过滤 ) 浓缩( 超过滤 超过滤)
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一 凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用

凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投 加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等 胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其 聚集起来,增大体积以便固液分离。 凝聚和絮凝技术常用于菌体细小而且黏度大 的发酵液的预处理中。

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凝聚和絮凝
凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。
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2.1 发酵液的预处理
（Pretreatment ）
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为何要对发酵液进行预处理？
发酵液的基本特性
发酵产物浓度较低，大多为1-10%， 悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似。 可压缩性 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动

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为何要对发酵液进行预处理？
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（三） 混 凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子 型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和 产生吸附桥架的双重机理，单独使用可达到较好 絮凝效果； 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用 凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果。 这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。
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二、降低液体粘度
非离子型 阴离子型
阳离子型
工业上使用的絮凝剂
可分为三类：人工合成有机高分子聚合物、天然有 机高分子聚合物、无机高分子聚合物 1）目前常用的是人工合成有机高分子聚合物，如聚 丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸 类和聚苯乙烯类衍生物。
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高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况 不同，可分为三类：阴离子型（含有羧基)、阳离子 型（含有胺基） 、非离子型