REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化
红曲霉菌生物代谢成分的研究进展_周波
!")$ *+,-./,+0 10+2
/01234105 6507 （ 见图 8 ） 在红曲产品中是一类具 有抗氧化功能的主要物质， 在体外 /99: ・实验检测 中有抗氧化特性以及对四氯化碳导致的小鼠损伤有
［$ ， #; ］ 保护作用 。 进 一 步 研 究 发 现， 一定量 （ %< =
图 .& S6CHT>1>C6D0C * 和 S6CHT>1>C6D0C + 的化学结构图
［! ］ 化并已经研究清楚其化学结构的包括莫纳可林 、 色 ［% ］ ［E ］ ［# ］ ［& ］ 素 、二 氢 莫 纳 可 林 、桔 霉 素 、 BDAD 、 ［’ ］ I2J38;J2+ 5+21 等， 这些物质根据其部分用途和生
就是抑制胆固醇生物合成中的关键酶 LMB) 9-D 还 原酶 （ E) 羟基 ) E ) 甲基 ) 戊二酰基 ) 辅酶 D 还原酶， E) ,?18-N?. ) E ) J3:,?. 7.;:58?. 9-D 831;+:5>3 ） 的活性。 最初 发 现 密 实 菌 素 （ +-JO5+:24 ， MP ) %E’A ） 能抑制
结构类似物莫纳可林 Q 的治疗效果更好， 莫纳可林
［ !! ］ Q 因此而被广泛研究 。
莫纳可林 Q 最初在 !"#$%&’% (’)*( 和 +%,*(-.//’%
［ !% ］ ， 然后被 M38+K 公司产业商品化并命 0*((*’% 中发现 ［ !E ］ 名为洛伐它汀 （ .-=5>:5:24 ） 。莫纳可林 Q 的代谢合 ［ !# ］ 成途径及其同系物都已研究清楚 。其同系物种类
红曲霉的研究进展_侯敏
42 卷 11 期
侯 敏等 红曲霉的研究进展
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提高［9 － 10］。 1． 2 红曲霉及桔霉素 1995 年，法国学者 Blanc 发现某些 红曲霉菌株代谢会产生对人畜有害的真菌毒素———桔霉素， 从而引起了人们对红曲霉中桔霉素问题的关注。桔霉素有 显著的肾脏毒性，毒性较明显，能引起试验动物的肾脏肿大、 尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状，并有致 癌性而且还能引发基因突变［11］。但是，并非所有的红曲菌 都会产生桔霉素，例如日本用红色红曲霉、毛红曲霉、紫色红 曲霉可以生产出不含桔霉素的产品，而且桔霉素的生产与否 和生产方法有关，生产工艺条件决定桔霉素的含量。我国有 关红曲 色 素 产 品 的 国 家 标 准 有 3 个，即 2005 年 颁 布 的 GB15961 － 2005《红曲红色素》、2008 年颁布的 GB4926 － 2008 《红曲米（ 粉） 》和 2009 年 3 月 1 日正式实施的 GB T5009． 222 － 2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》，另外还有一个功能 性红曲的轻工行业标准 QB / T2847 － 2007。但是现有的 2 个 红曲色素产品的国家标准中，均没有提及色素产品中桔霉素 的限量指标［12］。对于桔霉素的检测，因为在红曲产品中含 量较低，而且受其他物质干扰严重，测定的难度较大。目前， 桔霉素的检测方法有： 高效液相色谱法、酶联免疫法、抑菌圈 法、薄层层析法。其中，HPLC 测定桔霉素含量具有灵敏度 高、检测时间快速、定性定量准确可靠的特点。李志强等应 用 HPLC 方法在桔霉素浓度为 0． 005 mg / L 时仍可检出，而在 0． 002 mg / L 时检测不到桔霉素，因此确定 HPLC 方法对桔霉 素的最低检出限为 0． 005 mg / L［13］。 1． 3 红曲霉及洛伐他汀 洛伐他汀是最初从红曲霉菌中发 现的生理活性物质，用于治疗高胆固醇症，能阻止动脉硬化 发展，减少心肌梗塞等的发病危险［14］。因为其可以针对病 因，且具有疗效显著、毒副作用少、耐受性好等优点而受到广 泛重视和好评。临床证明，该物质有明显的降低血清总胆固 醇（ TC） 及血清中甘油三脂（ TG） 和升高血清高密度脂蛋白胆 固醇（ HDL-C） 的作用，该物质的特征为抗阻碍胆固醇合成系 统中的限速酶 HMG-CoA （ 3-羟基-3-甲基 － 戊二酰 CoA） 、还 原酶（ 羟戊二酰辅酶 A） ，且抑制作用最高［15］。虽然红曲霉 洛伐他汀的产量较低，但由于红曲菌在食品方面的安全性， 所以研究如何提高红曲菌洛伐他汀的发酵水平具有现实意 义。一般可以通过选育高产洛伐他汀菌株和改善发酵工艺 条件 2 种途径来实现。在菌种选育方面，刘月等利用种间双 亲灭活原生质体融合选育的融合株，以甘油为原料液，洛伐 他汀产量达到 1 752． 46 mg / L［16］； 张良利用紫外-LiCl 复合诱 变方法得到的菌株洛伐他汀的产量为 250． 54 μg / g［17］。目 前，发酵生产洛伐他汀多采用液体深层发酵工艺，红曲霉为 丝状真菌专性好氧，由于菌丝发达其游离细胞在搅拌罐中进 行深层发酵时，在罐中易形成菌丝团，引起氧气及其他营养 物质的传递困难，或由于菌丝缠绕于搅拌叶上，使搅拌阻力 增加，从而使产品产率低于传统固态发酵。王克明等采用聚 乙烯醇和海藻酸钠双载体固定红曲菌细胞，采用气升式生物 反应器发酵洛伐他汀，产量高达 2． 59 ～ 2． 68 mg / ml［18］。BoBo Zhang 等利用 4 mm × 4 mm × 4 mm 的琼脂块作为固体发
红曲霉的研究进展_侯敏
红曲霉的研究进展侯敏，周端顼，王艳新，唐帅，金海如*（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）摘要红曲霉是我国重要的微生物资源，被广泛应用于食品及药品等方面。
对红曲霉的营养成分开发利用及最新研究进展进行综述，并指出红曲霉研究中存在的问题及今后研究的主要方向。
关键词红曲霉;色素;洛伐他汀;桔霉素中图分类号S188文献标识码A 文章编号0517－6611(2014)11－03382－03Ｒesearch Progress of Monascus purpureus Went HOU Min ，JIN Hai-ru et al (College of Chemistry and Life Science ，Zhejiang Normal University ，Jinhua ，Zhejiang 321004)Abstract Monascus purpureus as the important filamentous fungus has been widely used in food ，medicine ，etc．The development and utilization of nutrients of Monascus purpureus and the latest research progress WEＲE summarized ，the existing problems in the research of Monascus purpu-reus and the main direction of future research were pointed out．Key words Monascus purpureus ;Pigment ;Lovastatin ;Citrinin基金项目国家自然科学基金项目(41371291);浙江省自然科学基金项目(LY12C01002);浙江省重中之重学科现代农业生物技术与作物病害防控开放基金项目。
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究
红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus）是一种重要的食品、药用真菌，具有制作红曹和红曲色素的能力。
红曲霉色素是一种天然的食品着色剂，被广泛应用于食品加工和制药工业。
而红曲霉也是一种可以用于生物转化生产脂质和多糖等重要化合物的微生物。
红曲霉高产菌株的筛选及固态发酵研究对于提高红曲霉发酵产物的产量和质量具有重要意义。
一、红曲霉高产菌株筛选1. 优良菌株的选择红曲霉菌株的筛选是红曲生物技术研究的关键之一。
目前，常用的筛选方法是通过对菌株的培养条件、生理生化特性以及代谢产物等进行评价，从中选取表现出高产、高效、高稳定性的优良菌株。
在筛选过程中，需要考虑到不同菌株之间的遗传变异、发酵产物的生产能力等因素，综合评价后确定优良菌株。
2. 根据菌株代谢产物进行筛选红曲霉菌株具备多样的代谢产物，包括红曲素、黄酮素、黄酮甾醇和多糖等。
在筛选优良菌株时，可以通过检测这些代谢产物的合成能力，选择产量高、纯度高、质量好的优良菌株。
还可以采用高通量筛选技术，如基因组学、代谢组学和蛋白质组学等方法，加快筛选速度，提高筛选效率，为选取优良菌株提供科学依据。
3. 利用基因工程技术筛选优良菌株利用基因工程技术，可以对红曲霉的代谢途径进行调控和优化，从而提高其生产产物的能力。
通过转录组分析和基因功能鉴定，可以筛选出与产物合成相关的关键基因，并通过基因工程技术对这些基因进行改造、调控，从而提高产物的产量和质量。
二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵的基本原理固态发酵是指微生物在不同有机物基质中进行生长和代谢过程。
相比于液态发酵，固态发酵具有体系复杂、生物多样性丰富、营养物质丰富等优点。
对于红曲霉来说，固态发酵可以有效提高产物的产量和质量，加快生长速度，促进代谢物的生成，增强抗胁迫能力。
2. 固态发酵的工艺优化固态发酵的工艺优化是红曲霉生物技术研究的重中之重。
优化工艺可以从发酵基质的选择、培养基成分、发酵条件等方面入手，通过对各项参数进行调控和优化，提高红曲霉的产物产量和质量。
紫色红曲霉Ｍｒｒ２_基因的过表达对桔霉素积累的影响
紫色红曲霉Ｍｒｒ２基因的过表达对桔霉素积累的影响唐光甫，满海乔，赵杰宏，韩洁∗㊀（贵州中医药大学／贵州省中药生药学重点实验室，贵州贵阳５５００２５）摘要㊀为研究红曲霉Ｍｒｒ２基因对桔霉素代谢的作用，通过农杆菌介导遗传转化获得Ｍｒｒ２过表达菌株，与野生型菌株相比，Ｍｒｒ２过表达导致菌丝中桔霉素含量显著增加，洛伐他汀和色素含量均有不同程度增加㊂ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示，Ｍｒｒ２过表达对其他桔霉素相关基因的表达有明显促进作用，推测Ｍｒｒ２对桔霉素的合成和积累具有重要影响，进一步丰富和完善了桔霉素合成调控途径，为桔霉素的消减提供理论依据㊂关键词㊀紫色红曲霉；过表达；桔霉素；红曲色素；Ｍｒｒ２基因中图分类号㊀Ｑ９３㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）２０－０００１－０５ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．２０．００１㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＥｆｆｅｃｔｏｆＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｒｒ２ＧｅｎｅｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓｏｎＣｉｔｒｉｎｉｎＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎＴＡＮＧＧｕａｎｇ⁃ｆｕ，ＭＡＮＨａｉ⁃ｑｉａｏ，ＺＨＡＯＪｉｅ⁃ｈｏｎｇｅｔａｌ㊀（ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ／ＫｅｙＬａｂｏｆＰｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓ⁃ｔｉｃｓｏｆＧｕｉｚｈｏｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ５５００２５）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅＭｒｒ２ｇｅｎｅｏｎｃｉｔｒｉｎｉｎ，ｔｈｅＭｒｒ２ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｒｒ２ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎｉｎｍｙｃｅｌｉａ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｏｖａｓｔａｔｉｎａｎｄｐｉｇｍｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｇｒｅｅ．ＲＴ⁃ｑＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｒｒ２ｐｒｏｍｏｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎｏｔｈｅｒｃｉｔｒｉｎｉｎ⁃ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＭｒｒ２ｈａｄｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎｃｉｔｒｉｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｆｕｒｔｈｅｒｅｎｒｉｃｈｉｎｇｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｇｅｎｅｓｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓ；Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｃｉｔｒｉｎｉｎ；Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔ；Ｍｒｒ２ｇｅｎｅ基金项目㊀贵州省科技支撑项目（黔科合支撑 ２０１９ ２７７６号）；国家自然科学基金项目（８１９６０６９２）㊂作者简介㊀唐光甫（１９９３ ），男，重庆人，硕士研究生，研究方向：药用微生物㊂∗通信作者，副教授，硕士，硕士生导师，从事药用微生物研究㊂收稿日期㊀２０２２－１２－０１；修回日期㊀２０２３－０３－０７㊀㊀红曲霉的生产和应用在我国及许多亚洲国家有着悠久的历史，被广泛用于食品添加剂㊁葡萄酒工业和医疗保健等方面［１］㊂红曲霉在生长过程中能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物，主要有红曲色素㊁洛伐他汀和γ－氨基丁酸［２－６］㊂红曲色素具有抗菌㊁抗肿瘤和抗氧化功能等生物活性［７－９］，可以取代部分亚硝酸盐被用于肉制品中抑制细菌生长［１０］㊂洛伐他汀是ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶抑制剂，已被ＦＤＡ批准用于高脂血症的治疗，还作为紫杉醇治疗前列腺癌细胞的化学增敏剂［１１］㊂但是，红曲霉在发酵过程中也会生产一种真菌毒素－桔霉素，其具有肝毒性㊁肾毒性㊁致癌和致畸作用［１２－１４］，严重制约了红曲产业的发展㊂目前，为了有效抑制红曲霉在发酵过程中桔霉素的积累，增加有益次级代谢产物的产生，国内外学者分别从菌种选育㊁发酵条件优化㊁分子调控等方面进行研究，并取得了重要进展㊂Ｚｈｅｎ等［１５］在发酵液中添加０．２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ能显著降低桔霉素的含量，并增加色素和洛伐他汀（ＭｏｎａｃｏｌｉｎＫ）的产量㊂Ｈａｊｊａｊ等［１６］利用同位素标记法深入探讨了１３Ｃ在桔霉素中的部分生物合成途径，结果表明桔霉素和红曲色素均由聚酮类生物合成途径产生，前期均由１分子乙酰ＣｏＡ和３分子丙二酰ＣｏＡ在ＰＫＳ酶的催化作用下形成四酮体，随后分开，一条途径与乙酰ＣｏＡ缩合，通过甲基化㊁缩合㊁还原㊁甲氧基化㊁还原㊁氧化和脱水等步骤最终形成桔霉素；另一条路径是４个酮基的聚酮链与丙二酰辅酶Ａ缩合，形成红曲色素中间产物，然后经过一系列步骤最终形成红曲色素㊂目前桔霉素的合成调控网络还有很多步骤不清楚㊂基因Ｍｒｒ２是红曲霉中一个功能未经试验证实的基因，编码一种变位酶，推测在红曲霉代谢调控中有重要作用㊂该研究采用农杆菌介导遗传转化获得Ｍｒｒ２过表达菌株，分析Ｍｒｒ２基因对红曲霉中桔霉素合成的影响，初步证实Ｍｒｒ２是红曲霉中桔霉素合成的重要调控基因㊂１㊀材料与方法１．１㊀菌株和试剂㊀紫色红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）菌株由贵州中医药大学生药学实验室提供㊂桔霉素标准品购自北京ＴＭｓｔａｎｄａｒｄ公司；Ｇｅｎｅｇｒｅｅｎ核酸染料㊁ＦａｓｔＫｉｎｇ一步法除基因组ｃＤＮＡ第一链合成预混试剂和Ｔａｌｅｎｔ荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；柱式真菌总ＲＮＡ抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司㊂Ｔａｑ酶购自北京索莱宝科技有限公司；Ｍｒｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＴ７８１０７５）过表达载体ｐＧＵＳ－Ｍｒｒ２（含ＰｇｐｄＡ－ＧＵＳ－Ｍｒｒ２－Ｔｎｏｓ表达框）由武汉淼灵生物构建㊂１．２㊀Ｍｒｒ２基因序列分析㊀利用Ｐｒｉｍｅｒ５ｐｌｕｓ设计Ｍｒｒ２引物序列（表１），ＰＣＲ扩增产物送北京六合华大基因公司测序验证㊂使用在线工具（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍＬ）预测Ｍｒｒ２编码的氨基酸序列㊂用ＢＬＡＳＴ程序中的ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）预测Ｍｒｒ２的功能㊂用ＭＥＧＡ１１进行同源性分析㊂１．３㊀农杆菌介导遗传转化㊀将ｐＧＵＳ－Ｍｒｒ２经冻融法转化农杆菌ＡＧＬ１感受态，涂布在含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素抗生素的固体ＬＢ培养基上筛选，对抗性单菌落进行ＰＣＲ检测㊂将获得的阳性菌株在含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素抗生素的液体ＬＢ培养基中培养，取菌液离心去除上清，用ＩＭ培养基稀释至ＯＤ６００值为０．１５ ０．２０，再在相同条件下培养４ ６ｈ，至其ＯＤ６００值为０．６ ０．８㊂用农杆菌菌液稀释红曲霉孢子至１０个／ｍＬ，取安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（２０）：１－５㊀㊀㊀２００μＬ涂布于铺有０．４５μｍ硝酸纤维素膜的Ｃｏ－ＩＭ平板上㊂２５ħ暗培养３ｄ，将长出的红曲霉菌落和硝酸纤维素膜一起揭下，倒置在含２０ｍｇ／Ｌ潮霉素和３００ｍｇ／Ｌ头孢霉素的培养基上筛选㊂待农杆菌无生长后揭下硝酸纤维素膜，挑取抗性红曲霉单菌落，利用Ｈｙｇ和ＧＵＳ引物（表１）进行ＰＣＲ检测，对菌丝体进行ＧＵＳ染色验证㊂表１㊀ＰＣＲ及ＲＴ－ｑＰＣＲ检测引物Ｔａｂｌｅ１㊀ＰｒｉｍｅｒｓｆｏｒＰＣＲａｎｄＲＴ⁃ｑＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ靶标基因Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄ－３ᶄ）备注ＲｅｍａｒｋｓＨｙｇＨｙｇ－ＦＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＧＧＧＡＧＴＴ检测引物Ｈｙｇ－ＲＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＣＴＣＧＴＡＴＴ检测引物ＧＵＳＧＵＳ－ＦＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡ检测引物ＧＵＳ－ＲＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴ检测引物Ｍｒｒ２Ｑ－Ｍｒｒ２－ＦＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＴＣＡＴＣＣＡＴＴＧＣ全长扩增引物Ｑ－Ｍｒｒ２－ＲＴＴＡＣＧＣＴＧＴＡＣＧＴＣＣＴＣＴＧＣ全长扩增引物Ｍｒｒ２－ＦＣＣＡＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴ检测引物Ｍｒｒ２－ＲＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴ检测引物ＣｔｎＡＣｔｎＡ－ＦＡＡＡＴＧＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＡ－ＲＧＧＡＡＴＴＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＧＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＣＣｔｎＣ－ＦＣＡＴＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＣ－ＲＴＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＧＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＤＣｔｎＤ－ＦＣＴＡＣＴＣＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＤ－ＲＣＴＡＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＥＣｔｎＥ－ＦＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＴＧＧＴＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＣｔｎＥ－ＲＴＡＣＡＴＣＣＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＴＣＡＲＴ－ｑＰＣＲ引物ｐｋｓＰＴｐｋｓＰＴ－ＦＧＡＴＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＧＣＧＡＡＧＡＲＴ－ｑＰＣＲ引物ｐｋｓＰＴ－ＲＣＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＧＧＡＴＴＴＧＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＭｐｉｇＥＭｐｉｇＥ－ＦＴＧＴＣＣＧＡＣＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＡＡＲＴ－ｑＰＣＲ引物ＭｐｉｇＥ－ＲＴＡＴＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＡＴＲＴ－ｑＰＣＲ引物Ｍｒｒ２Ｍｒｒ２－ＦＣＣＡＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＲＴ－ｑＰＣＲ引物Ｍｒｒ２－ＲＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＲＴ－ｑＰＣＲ引物１．４㊀色素和洛伐他汀的检测㊀将野生菌株（ＷＴ）和过表达菌株（Ｍｒｒ２－１㊁Ｍｒｒ２－２）的孢子悬液接种在沙氏液体培养基中，于２８ħ㊁１４０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１４ｄ㊂过滤收集菌丝体，４５ħ干燥后粉碎㊂测定红曲色素时精密称取０．１００ｇ菌丝体粉末于１０ｍＬ具塞试管中，加入１０ｍＬ７０％乙醇摇匀，６０ħ水浴１ｈ，取出冷却后补足至１０ｍＬ，过滤，将续滤液倒入２５ｍＬ容量瓶中定容，在４１０㊁４６５和５０５ｎｍ处分别测定黄㊁橙㊁红色素，并计算色价：色价（Ｕ／ｇ）＝吸光度ˑ稀释倍数ˑ浸提溶剂体积／样品质量㊂测定洛伐他汀时取１ｍＬ发酵液于５０ｍＬ三角瓶中，加入９ｍＬ７０％乙醇混匀㊂放入２８ħ恒温振荡器１４０ｒ／ｍｉｎ振荡１ｈ后取出，加入２ｍＬ离心管中，以４２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液，测定２３７ｎｍ处吸光度来判断洛伐他汀含量㊂１．５㊀桔霉素测定㊀精密称取０．１５ｇ干燥菌丝体加入１０ｍＬ甲醇，超声处理３０ｍｉｎ后，７０ħ水浴１ｈ，用０．４５μｍ滤膜过滤㊂色谱条件：Ｃ１８柱（４．６ｍｍˑ１５０ｍｍ，５μｍ），流动相为２％醋酸水（磷酸溶液调节ｐＨ至２．５）ʒ乙腈＝４６ʒ５４，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；柱温２８ħ；检测器为ＰＤＡ二极管阵列检测器㊂检测波长３３０ｎｍ，进样量２０μＬ㊂１．６㊀荧光定量检测㊀按照试剂盒说明书提取液态培养１４ｄ的红曲霉菌株的ＲＮＡ，参照ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ试剂盒进行ＲＴ－ｑＰＣＲ分析㊂用于基因表达分析的特异性基因ＣｔｎＡ（Ｇｅｎ⁃Ｂａｎｋ：ＡＢ２４３６８７）㊁ＣｔｎＣ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２４３６８７）㊁ＣｔｎＤ（Ｇｅｎ⁃Ｂａｎｋ：ＥＵ３０９４７４）㊁ＣｔｎＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ３０９４７４）㊁Ｍｒｒ２㊁ｐｋｓＰＴ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＦ８３２９１６）㊁ＭｐｉｇＥ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ２８５４３１）㊁Ａｃｔｉｎ（ＡＪ４１７８８０）如表１所示㊂ｑＰＣＲ反应体系包括２μＬｃＤＮＡ模板㊁１０μＬ２ˑＴａｌｅｎｔｑＰＣＲＰｒｅＭｉｘ㊁０．６μＬ１０μｍｏｌ／Ｌ的正反向引物，ｄｄＨ２Ｏ补足至２０μＬ㊂使用ＳｔｅｐＯｎｅ软件（ＡＢＩＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）分析表达数据，采用２－ΔΔＣｔ法计算相对于内参基因Ａｃｔｉｎ的转录水平㊂１．７㊀数据统计及显著性分析㊀试验数据以Ｇｒａｇｈｐａｄｐｒｉｓｍ软件分析，以 平均值ʃ标准偏差 （ＭｅａｎʃＳＤ）表示㊂分析方法为单因素方差分析㊁多重比较㊁Ｔｕｒｋｅｙ检验㊂２㊀结果与分析２．１㊀Ｍｒｒ２基因克隆和序列分析㊀从紫色红曲霉基因组中扩增了一个１４２８ｂｐ的ＤＮＡ片段㊂Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ在线工具分析Ｍｒｒ２序列由５个开放阅读框（ＯＲＦ）和４个内含子组成（图１Ａ）㊂ＣＤ－ｓｅａｒｃｈ预测Ｍｒｒ２结构域发现，Ｍｒｒ２属于（ＨＰ）ｓｕ⁃ｐｅｒ⁃ｆａｍｉｌｙ（ＨＰ＿ＰＧＭ＿ｌｉｋｅ），ＨＰ超家族结构域的保守催化核心是Ｈｉｓ残基，在反应过程中被磷酸化㊂主要包括辅助因子图１㊀Ｍｒｒ２基因的序列结构（Ａ）和同源性（Ｂ）分析Ｆｉｇ．１㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ａ）ａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｂ）ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＭｒｒ２ｇｅｎｅ２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年依赖和辅助因子独立的磷酸甘油酸变位酶（分别为ｄＰＧＭ和ＢＰＧＭ）㊁果糖－２，６－二磷酸酶（Ｆ２６ＢＰ）㊁Ｓｔｓ－１㊁ＳｉｘＡ和相关蛋白㊂利用ＭＥＧＡ１１软件进行同源性分析（图１Ｂ）发现，Ｍｒｒ２与Ｍ．ｒｕｂｅｒ预测序列ｍｒｒ２的同源性达１００％，与Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｃｌａｖａｔｕｓ的未知序列相似性达８３．２３％㊂２．２㊀Ｍｒｒ２过表达菌株的获得㊀过表达载体ｐＧＵＳ－Ｍｒｒ２包含Ｍｒｒ２与ＧＵＳ形成的融合基因，经冻融法转化农杆菌ＡＧＬ１感受态，对抗性平板上的农杆菌菌落进行ＰＣＲ检测，得到抗性菌落，再与紫色红曲霉孢子悬液共培养，获得的抗性红曲霉菌株转接到含有潮霉素和头孢霉素的平板上进行筛选，对阳性红曲霉菌株及野生型的菌丝体进行ＧＵＳ染色分析，可以清晰看到菌丝细胞内容物呈蓝色，而野生型细胞为透明无色或淡黄色（图２），表明转基因菌株能够正常表达ＧＵＳ基因㊂利用Ｈｙｇ和ＧＵＳ引物进行ＰＣＲ验证，均能扩增出正确的目的片段（图３），表明获得了转化成功的红曲霉菌株㊂对过表达菌株连续传代５次，能够稳定遗传，表明抗性菌株具有良好的稳定性㊂与野生菌株相比，过表达Ｍｒｒ２的红曲霉菌株菌落直径较大，色素分泌偏多，气生菌丝蓬松㊁浓密且长（图４）㊂但后期区分不明显，可能是随着时间的延长，营养物质被消耗㊂推测Ｍｒｒ２过表达以后能够促进红曲霉的生长㊂图２㊀野生型菌株（Ａ）和过表达菌株（Ｂ）的ＧＵＳ染色Ｆｉｇ．２㊀ＧＵＳｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ（Ａ）ａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｔｒａｉｎ（Ｂ）注：Ｍ为ＤＬ１０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１ ８为过表达菌株㊂Ｎｏｔｅ：ＭｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＤＬ１０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１－８ａｒｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｔｒａｉｎｓ．图３㊀Ｈｙｇ（Ａ）和ＧＵＳ（Ｂ）引物ＰＣＲ检测Ｆｉｇ．３㊀Ｈｙｇ（Ａ）ａｎｄＧＵＳ（Ｂ）ｐｒｉｍｅｒＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ２．３㊀色素和桔霉素分析㊀采用ＨＰＬＣ检测桔霉素含量，与野生型菌株相比，胞内桔霉素产量增加了６５％ １５１％，Ｍｒｒ２过表达的菌株内红㊁黄㊁橙３种色素分别增加了２０％ ２５％㊁１４％ １５％和１２％ ４２％，胞外洛伐他汀含量有显著增加（图５ ６）㊂胞外桔霉素略有增加，可能是发酵时间延长，部分菌体自溶，导致胞内桔霉素释放到发酵液中的原因㊂２．４㊀ＲＴ－ｑＰＣＲ分析㊀为了检测Ｍｒｒ２及其他桔霉素代谢相关基因的转录水平变化，经ＲＴ－ｑＰＣＲ分析结果显示，过表达菌株中Ｍｒｒ２的转录表达量明显成倍增加，与桔霉素合成相关的ＣｔｎＡ㊁ＣｔｎＤ㊁ＣｔｎＥ㊁ｐｋｓＰＴ以及色素相关基因ＭｐｉｇＥ的转录有明显增加（图７），表明Ｍｒｒ２的高表达引起其他桔霉素和色素合成相关基因的表达变化㊂３㊀讨论与结论桔霉素是一种由不同种类的曲霉㊁青霉和红曲霉菌等产生的真菌毒素［１７］，对人和动物都有肝肾毒性和基因毒性作用，对人类和动物健康构成了严重的风险，引起了人们对食用污染食物和饲料的担忧㊂因此研究桔霉素的合成调节机制对于消减和防控桔霉素污染有重要意义㊂２０１０年，Ｊｉａ等［１８］通过农杆菌介导的转化成功破坏了紫色红曲霉ＳＭ００１中的ｐｋｓＣＴ基因，导致该菌株基本丧失了产生桔霉素的能力㊂同样ＣｔｎＢ突变体也几乎不产生桔霉素［１９］，但是ＣｔｎＧ基因的破坏在降低了桔霉素的同时也降低了色素的产生［２０］㊂用去除内含子的ｍｐｌ６和ｍｐｌ７共转化携带ｐｋｓＣＴ㊁ｎｐｇＡ㊁ｍｐｌ１㊁ｍｐｌ２和ｍｐｌ４的毕赤酵母菌株，在甲醇诱导下成功生产出桔霉素［２１］㊂此外，Ｇ蛋白Ｇα亚基基因（Ｍｇａ１）㊁Ｇβ亚基基因（Ｍｇｂ１）或Ｇγ亚基基因（Ｍｇｇ１）的破坏增强了Ｍ．ｒｕｂｅｒ中桔霉素和色素的生成［２２－２３］㊂然而，ｍｒ⁃ｓｋｎ７基因突变株在Ｍ．ｒｕｂｅｒ中或Ａｓｈ２基因突变株在Ｍ．ｐｕｒｐｕ⁃３５１卷２０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐光甫等㊀紫色红曲霉Ｍｒｒ２基因的过表达对桔霉素积累的影响注：ＷＴ为野生菌株；Ｍｒｒ２－１㊁Ｍｒｒ２－２为过表达菌株㊂Ｎｏｔｅ：ＷＴｉｓａｗｉｌｄｓｔｒａｉｎ；Ｍｒｒ２⁃１ａｎｄＭｒｒ２⁃２ａｒｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｔｒａｉｎｓ．图４㊀Ｍｒｒ２过表达红曲霉菌株的菌落特征Ｆｉｇ．４㊀ＣｏｌｏｎｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＭｏｎａｓｃｕｓｓｔｒａｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｗｉｔｈＭｒｒ２图５㊀标准品（ａ）和样品（ｂ）中桔霉素的ＨＰＬＣ色谱图Ｆｉｇ．５㊀ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎｉｎｓｔａｎｄａｒｄ（ａ）ａｎｄｓａｍｐｌｅ（ｂ）图６㊀过表达菌株胞内外化学成分的检测Ｆｉｇ．６㊀Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｔｒａｉｎｓ４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年图７㊀Ｍｒｒ２过表达菌株的ＲＴ－ｑＰＣＲ检测Ｆｉｇ．７㊀ＲＴ⁃ｑＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｒｒ２ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｔｒａｉｎｓｒｅｕｓ中产生的真菌毒素较少［２４－２５］㊂以上研究为后续筛选高产莫纳可林Ｋ㊁低产桔霉素的红曲霉菌株提供理论依据［２６］㊂而至今对桔霉素的合成调控网络依然没有研究清楚㊂红曲霉Ｍｒｒ２基因是一个功能未知的变位酶基因，推测在红曲霉代谢调控中有重要作用，为研究红曲霉Ｍｒｒ２基因对桔霉素合成的影响，该研究通过农杆菌转化获得了Ｍｒｒ２过表达的红曲霉菌株㊂与野生型的次级代谢产物和菌落形态相比较，发现过表达Ｍｒｒ２基因对桔霉素的合成有促进作用，增加了桔霉素和色素的胞内积累，胞外洛伐他汀含量也明显增加㊂过表达菌株的菌落颜色较野生型转色快，菌丝蓬松且致密㊂ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示，过表达Ｍｒｒ２对ＣｔｎＡ㊁ＣｔｎＤ㊁ＣｔｎＥ㊁ｐｋｓＰＴ㊁ＭｐｉｇＥ的转录有一定的促进作用，初步证明了过表达Ｍｒｒ２对桔霉素的合成有正向调控作用，为丰富和完善桔霉素的合成调控途径提供理论依据，对红曲产品的安全生产具有一定的指导意义㊂参考文献［１］ＳＲＩＡＮＴＡＩ，ＲＩＳＴＩＡＲＩＮＩＳ，ＮＵＧＥＲＡＨＡＮＩＩ，ｅｔａｌ．ＲｅｃｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＭｏｎａｓｃｕｓｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．ＩｎｔＦｏｏｄＲｅｓＪ，２０１４，２１（１）：１－１２．［２］ＧＡＯＪＭ，ＹＡＮＧＳＸ，ＱＩＮＪＣ．Ａｚａｐｈｉｌｏｎｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＣｈｅｍＲｅｖ，２０１３，１１３（７）：４７５５－４８１１．［３］ＣＯＲＲÊＩＡＧＯＭＥＳＤ，ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＪＡ．Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｆｕｎｇａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ－ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅａｒｅｄｐｉｇｍｅｎｔｆｒｏｍｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｉｎ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１６，２１０：３５５－３６１．［４］ＴＥＲÁＮＨＩＬＡＲＥＳＲ，ＤＥＳＯＵＺＡＲＡ，ＭＡＲＣＥＬＩＮＯＰＦ，ｅｔａｌ．ＳｕｇａｒｃａｎｅｂａｇａｓｓｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｅｅｄｓｔｏｃｋｆｏｒｒｅｄｐｉｇｍｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＭｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１８，２４５：７８６－７９１．［５］ＰＡＴＡＫＯＶＡＰ．Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＪＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，４０（２）：１６９－１８１．［６］ＷＡＮＧＬＬ，ＤＡＩＹ，ＣＨＥＮＷＰ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｉｇｈｔｉｎｔｅｎｓｉｔｙａｎｄｃｏｌｏｒｏｎｔｈｅｂｉｏｍａｓｓ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｄｐｉｇｍｅｎｔ，ａｎｄｃｉｔｒｉｎｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＭｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１６，６４（５０）：９５０６－９５１４．［７］ＣＨＡＮＧＹＹ，ＨＳＵＷＨ，ＰＡＮＴＭ．Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｍｏ⁃ｎａｓｃｉｎａｎｄａｎｋａｆｌａｖｉｎｉｎｈｉｂｉｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＲＢＬ⁃２Ｈ３ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１５，６３（１）：１９２－１９９．［８］ＣＨＥＮＧＣＦ，ＰＡＮＴＭ．Ａｎｋａｆｌａｖｉｎａｎｄｍｏｎａｓｃｉｎｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎａｃｔｉ⁃ｖａｔｅｄｈｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＡｋｔ／ＮＦ⁃κＢ／ｐ３８ｓｉｇ⁃ｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１６，６４（４９）：９３２６－９３３４．［９］ＨＳＵＬＣ，ＬＩＡＮＧＹＨ，ＨＳＵＹＷ，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉ⁃ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｙｅｌｌｏｗａｎｄｏｒａｎｇｅｐｉｇｍｅｎｔｓｆｒｏｍＭｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓＮＴＵ５６８［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１３，６１（１１）：２７９６－２８０２．［１０］ＶＥＮＤＲＵＳＣＯＬＯＦ，ＭＥＩＮＩＣＫＥＢÜＨＬＥＲＲＭ，ＤＥＣＡＲＶＡＬＨＯＪＣ，ｅｔａｌ．Ｍｏｎａｓｃｕｓ：Ａｒｅａｌｉｔｙｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｉｇ⁃ｍｅｎｔｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，１７８（２）：２１１－２２３．［１１］ＬＩＹ，ＣＨＥＮＳＳ，ＺＨＵＪＹ，ｅｔａｌ．Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎｅｎｈａｎｃｅｓｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌ⁃ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＣＹＰ２Ｃ８［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，２０２２，５８９：８５－９１．［１２］ＷＡＮＧＨＱ，ＺＨＡＮＧＳＦ，ＬＩＮＴＦ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｓａｆｅｔｙｅｖａｌｕａ⁃ｔｉｏｎｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎｉｎｆｏｏｄｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＮｕｔｒＳｃｉ，２０１７（５）：１７９－１８３．［１３］ＤＥＯＬＩＶＥＩＲＡＦＩＬＨＯＪＷＧ，ＩＳＬＡＭＭＴ，ＡＬＩＥＳ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎ⁃ｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍＴｏｘｉｃｏｌ，２０１７，１１０：１３０－１４１．［１４］ＧＯＮＧＬ，ＺＨＵＨ，ＬＩＴＴ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｉｇｎａｔｕｒｅｓｏｆｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｉｎｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙ２９３ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅａｎｄｍｉｘｔｕｒｅｏｆｏｃｈ⁃ｒａｔｏｘｉｎＡａｎｄｃｉｔｒｉｎｉｎ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍＴｏｘｉｃｏｌ，２０１９，１２３：３７４－３８４．［１５］ＺＨＥＮＺＸ，ＸＩＯＮＧＸＱ，ＬＩＵＹＢ，ｅｔａｌ．ＮａＣｌｉｎｈｉｂｉｔｓｃｉｔｒｉｎｉｎａｎｄｓｔｉｍｕ⁃ｌａｔｅｓＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｓａｎｄｍｏｎａｃｏｌｉｎＫｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｎｓ，２０１９，１１（２）：１－１０．［１６］ＨＡＪＪＡＪＨ，ＫＬＡＥＢＥＡ，ＬＯＲＥＴＭＯ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｃｉｔｒｉｎ⁃ｉｎｉｎｔｈｅｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｕｓＭｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒａｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙ１３Ｃｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，６５（１）：３１１－３１４．［１７］ＫＡＭＬＥＭ，ＭＡＨＡＴＯＤＫ，ＧＵＰＴＡＡ，ｅｔａｌ．Ｃｉｔｒｉｎｉｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｃｏｎｔａｍｉ⁃ｎａｔｉｏｎｉｎｆｏｏｄａｎｄｆｅｅｄ：Ｉｍｐａｃｔｏｎａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ，ａｎｄｄｅｔｅｃ⁃ｔｉｏｎａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｎｓ，２０２２，１４（２）：１－２５．［１８］ＪＩＡＸＱ，ＸＵＺＮ，ＺＨＯＵＬＰ，ｅｔａｌ．ＥｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｃｉｔｒｉｎｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｔｒａｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓＳＭ００１［Ｊ］．ＭｅｔａｂＥｎｇ，２０１０，１２（１）：１－７．［１９］ＬＩＹＰ，ＰＡＮＹＦ，ＺＯＵＬＨ，ｅｔａｌ．Ｌｏｗｅｒｃｉｔｒｉｎｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｇｅｎｅｄｉｓ⁃ｒｕｐｔｉｏｎｏｆＣｔｎＢｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｉｔｒｉｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＭｏｎａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａｃｕｓＬｉＡＳ３．４３８４［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０１３，６１（３０）：７３９７－７４０２．［２０］ＬＩＹＰ，ＴＡＮＧＸ，ＷＵＷ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＣｔｎＧｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｓｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙ⁃ｄｒａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｃｉｔｒｉｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｆｒｏｍＭｏｎａｓｃｕｓａｕｒａｎｔｉａ⁃ｃｕｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＡｄｄｉｔＣｏｎｔａｍＰａｒｔＡＣｈｅｍＡｎａｌＣｏｎｔｒｏｌＥｘｐｏＲｉｓｋＡｓｓｅｓｓ，２０１５，３２（４）：５７７－５８３．［２１］ＸＵＥＹ，ＫＯＮＧＣＸ，ＳＨＥＮＷ，ｅｔａｌ．ＭｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｙｅａｓｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓａｓａｃｈａｓｓｉｓｏｒｇａｎｉｓｍｆｏｒｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｖｉａｔｈｅｆｕｌｌｃｉｔｒｉｎｉｎｂｉｏｓｙｎ⁃ｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７，２４２：６４－７２．［２２］ＬＩＬ，ＳＨＡＯＹＣ，ＬＩＱ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｇａ１，ａＧ⁃ｐｒｏｔｅｉｎａｌｐｈａ⁃ｓｕｂｕｎｉｔｇｅｎｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｉｔｒｉｎｉｎａｎｄｐｉｇｍｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒＭ７［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，２０１０，３０８（２）：１０８－１１４．［２３］ＬＩＬ，ＨＥＬ，ＬＡＩＹ，ｅｔａｌ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＧβｇｅｎｅＭｇｂ１ａｎｄｔｈｅＧγｇｅｎｅＭｇｇ１ｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ［Ｊ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４，５２（１）：３５－４３．［２４］ＳＨＡＯＹＣ，ＹＡＮＧＳ，ＺＨＡＮＧＺＷ，ｅｔａｌ．ｍｒｓｋｎ７，ａｐｕｔａｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｒｅｇ⁃ｕｌａｔｏｒｇｅｎｅｏｆＭｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒＭ７，ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｍｙｃｏｔｏｘｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，２０１６，１０８（５）：８５１－８５９．［２５］ＣＨＥＮＹＦ，ＬＩＵＹＢ，ＺＨＡＮＧＪＬ，ｅｔａｌ．Ｌａｃｋｏｆｔｈｅｈｉｓｔｏｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓ⁃ｆｅｒａｓｅｇｅｎｅＡｓｈ２ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｅｌｏｓｓｏｆｃｉｔｒｉｎｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＭｏｎａｓｃｕｓｐｕｒｐｕｒｅｕｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＰｒｏｔ，２０２０，８３（４）：７０２－７０９．［２６］庄月娥，陈华观．高产莫纳可林Ｋ㊁低产桔霉素的红曲霉菌株筛选及其发酵条件优化［Ｊ］．福建农业科技，２０２０（１）：６－１０．５５１卷２０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐光甫等㊀紫色红曲霉Ｍｒｒ２基因的过表达对桔霉素积累的影响。
红曲霉色素及代谢物研究进展
红曲霉色素及代谢物研究进展林凤; 李慧敏; 王玉梅; 毛瑞丰【期刊名称】《《中国调味品》》【年(卷),期】2019(044)012【总页数】4页(P188-191)【关键词】红曲霉; 红曲色素; 代谢产物【作者】林凤; 李慧敏; 王玉梅; 毛瑞丰【作者单位】广西大学轻工与食品工程学院南宁 530004【正文语种】中文【中图分类】TS264.4红曲霉属于子囊菌，能产生耐热的子囊孢子，且红曲霉能在缺氧、高酸和高盐浓度下生存[1]。
红曲霉可用于酿酒(黄酒、果酒和药酒)、制作发酵食品(腐乳、酱菜)、食品着色及保健品等。
红曲产品在亚洲地区广为流传，常见的为由大米发酵制成的红曲米，简称红曲，其被当做功能性食品已有数千年历史[2]。
红曲最初被记载于《饮膳正要》，别名为赤曲、丹曲、红米、福曲、红大米、红槽等。
《本草纲目》中对其评价为“此乃人窥造化之巧者也”，“奇药也”。
此外，在《本草衍义补遗》、《医林纂要》等中药典籍中也均对红曲有记载。
为研究红曲米中真菌多样性，采用以宏基因高通量测序技术为导向的真菌鉴定和检测方法对广西不同地区的红曲米进行检测，探究红曲米中真菌的群落种类、数量，获取其多样性信息。
1 材料和方法1.1 样品来源红曲米：采集于广西大瑶山不同地区。
1.2 试剂和仪器E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒：OMEGA公司；Qubit 3.0 DNA检测试剂盒：Life公司；2×Taq Master Mix：Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：TransGen公司。
台式离心机 Thermo Fisher公司；漩涡混合器海门市其林贝尔仪器制造有限公司；混匀型干式恒温器深圳拓能达科技有限公司；电泳仪电源、电泳槽北京市六一仪器厂；凝胶成像系统美国UVP公司；Qubit® 3.0荧光计 Invitrogen公司；PCR 仪 BIO-RAD公司；移液器 Eppendorf公司。
CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化
CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化目录一、内容概述 (2)1.1 CRISPR技术简介 (2)1.2 链霉菌细胞工厂的重要性 (3)1.3 CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的潜力 (4)二、CRISPR技术的基本原理与操作 (5)2.1 CRISPR-Cas9系统概述 (6)2.2 基因编辑的基本步骤 (8)2.3 CRISPR技术在链霉菌中的应用策略 (9)三、CRISPR技术在链霉菌基因组编辑中的应用 (10)3.1 基因敲除与插入 (11)3.2 基因表达调控 (12)3.3 蛋白质工程与代谢途径优化 (14)四、CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的优化策略 (15)4.1 代谢途径的强化 (16)4.2 抗性筛选与性状鉴定 (17)4.3 细胞工厂的稳定性和可重复性 (18)五、CRISPR技术在链霉菌中的实际应用案例 (20)5.1 抗生素生产优化 (21)5.2 生物燃料生产 (22)5.3 代谢产物的合成 (24)六、挑战与展望 (25)6.1 技术挑战与解决方案 (26)6.2 行业发展趋势 (27)6.3 未来研究方向与应用前景 (28)七、结论 (29)7.1 CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的重要成果 (30)7.2 对工业生物技术的贡献与影响 (31)一、内容概述CRISPR技术，作为一种革命性的基因编辑工具，近年来在生物医学领域引起了广泛关注。
其高效、精确的特性使得科学家能够以前所未有的精度对生物体的基因进行操作，为生物工程和合成生物学的发展提供了强大的支持。
特别是将CRISPR技术应用于链霉菌细胞工厂，不仅为抗生素生产、生物燃料合成等工业应用开辟了新途径，还极大地推动了微生物细胞工厂的优化和升级。
链霉菌作为一类重要的革兰氏阳性菌，具有独特的代谢途径和生物学特性，使其成为生物工程领域理想的宿主。
传统的链霉菌基因编辑方法存在效率低下、操作复杂等问题，限制了其在工业生产中的广泛应用。
红曲霉代谢产物的研究进展_李雪梅
研究表明， 橘黄色素 rubropuntatin
和 monascorubrin 对细菌、 酵母和丝状真菌具有抗菌 活性，而且可抑制枯草杆菌 Bacillus subtilis 和热带 念珠菌 Candida pseudotropicalis 的生长。黄色素 monascin 和 ankaflavin 对小鼠脾脏 T 细胞具有免疫 抑制活性。 除了上述 6 种主要色素以外，近年来科学家们 从红曲代谢产物中陆续分离得到了许多其他色素类 化合物。1992 年，Sato 等[14]首次从红曲霉诱变株中 分离了具有 furanoisophthalide 新骨架的黄色素类化 合物 xanthomonasin A（7）和 xanthomonasin B（8） 。 Akihisa 等
[18]
从 M. kaoliang Iizuka
H. & Lin C. F. 二次诱变株发酵的大米中， 分离得到 了黄色素 monascusone A （15） 、 monascusone B （16） 及已知化合物 FK17-P2b2（17） 。
·1020·
中草药
Chinese Traditional and Herbal Drugs
[15]
发现 xanthomonasins A、B 具有较强的
[16]
NO 清除活性。 Izawa 等
研究表明， xanthomonasin
A与B （3∶2） 的混合物对诱变剂 Trp-P-2 （NHOH） 具有较强的抗突变功能。 1996 年，Hossain 等
[17]
从紫色红曲霉 IFO30878
要：红曲霉能产生令人瞩目的许多聚酮类次级代谢产物，主要包括红曲色素、monacolins 类化合物、桔霉素及其他聚酮
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REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化作者：周礼红，陈平，赵永霞，等来源：《湖北农业科学》 2012年第18期周礼红，陈平，赵永霞，荆雯雯，李祝，葛永仪（贵州大学生命科学学院，贵阳５５００２５）摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ＲＥＭＩ）技术介导的红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素B作为抗性筛选标记，ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１作为转化质粒，采用ＲＥＭＩ技术转化红曲霉。
结果表明，用ＲＥＭＩ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３适合于红曲霉的转化。
环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ＲＥＭＩ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时，每微克质粒可获得的潮霉素Ｂ抗性转化子为２８００～３２００个；ＨｉｎｄⅢ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０Ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μＬ时转化率最高。
关键词：红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（REMI）中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4129-05限制性内切酶介导的整合（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＤＮＡ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ＲＥＭＩ）技术是将ＤＮＡ转化进入真核细胞，并产生非同源整合的一种方法。
ＲＥＭＩ的非同源整合机理与非同源末端连接（Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）相关［１－４］，整合的过程［５］可简单归结为三步：首先在转化过程中使线性化ＤＮＡ的酶随线性化ＤＮＡ进入核内；第二，限制性内切酶在特定识别位点酶切宿主染色体ＤＮＡ；第三，染色体ＤＮＡ和转化片段在体内互补末端连接产生非同源整合事件。
１９９１年Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次将ＲＥＭＩ技术应用于极易同源整合的Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
Ｋｕｓｐａ等［７］首先将ＲＥＭＩ技术应用于Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆发育基因，构建了ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ（限制性片段长度多态性）图谱［８，９］，并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究变得更加容易。
应用该方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子［５］。
ＲＥＭＩ技术还成功应用于子囊菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ［１１］、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遗传互补分析，以及启动子捕获等。
研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切缓冲液和不同质粒对转化率的影响，同时优化了酶的用量、受体细胞浓度等条件。
１材料与方法１．１材料１．１．１菌株、质粒与培养基菌株Ｍ７５７７是野生型红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓａｎｋａ），由贵州大学真菌资源研究所分离、保存。
用于遗传转化的质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ由法国Ｓｉｌａｒ教授惠赠，该质粒携带潮霉素Ｂ抗性基因（ｈｐｈ）［１３］，是用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶切线性化的。
质粒ｐＡＮ７－１［１４］带有来自Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｇｐｄ基因的启动子和ｔｒｐＣ基因［１５］的终止子。
用ＨｐｈⅠ酶切质粒ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补平末端，再用ＢａｍＨⅠ酶切得到１．１ｋｂｈｐｈ基因片段（ｈｐｈ基因缺失了不影响酶功能的前３个密码子）［１６］，与Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ带有起始密码子ＡＴＧ的ｇｐｄ基因５′端融合；ｈｐｈ基因下游密码子区域与Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓｔｒｐＣ基因末端区域的ＨｐｈⅠ－ＢａｍＨⅠ片段融合，克隆到质粒ｐＡＮ５２－１（克隆前先用ＮｃｏⅠ酶切ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补平末端，再用ＢａｍＨＩ酶切）上构建得到ｐＡＮ７－１。
质粒ｐＣＢ１００３带有来自ｐＣＳＮ４３［１７］的２．４ｋｂＳａｌⅠ片段（含有潮霉素Ｂ抗性基因ｈｐｈ和来自Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｔｒｐＣ启动子和终止子），通过单个碱基的改良消除了ｈｐｈ基因中的４个限制性内切酶位点：ＥｃｏＲⅠ（ＧＡＧＴＴＣ）、ＰｓｔⅠ（ＣＴＧＧＡＧ）、ＳｓｔⅡ（ＣＣＧＣＧＣ）和ＢａｍＨＩ（ＧＧＴＴＣＣ），但ｈｐｈ基因编码的氨基酸序列未变。
通过ＰＣＲ技术消除ｔｒｐＣ终止子，获得了１．４ｋｂ的片段，并在片段两端引入ＥｃｏＲⅠ、ＳａｌⅠ和ＨｐａⅠ位点，最后通过ＥｃｏＲⅠ位点亚克隆到ｐＵＣ１９构建得到ｐＣＢ１００３。
菌丝生长的ＣＭ培养基和产孢培养基按文献［１８］配制，原生质体再生液体和固体培养基是分别于ＣＭ液体和琼脂糖固体培养基中加入蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／Ｌ；复苏液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基中加蔗糖，终浓度为０．６ｍｏｌ／Ｌ。
１．１．２药品与试剂各种限制性内切酶和ｐｆｕＤＮＡ聚合酶为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｌｙｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅ购于Ｓｉｇｍａ公司，Ｓｎａｉｌａｓｅ购于华美生物工程公司，琼脂糖购于Ｂｉｏｗｅｓｔ公司，质粒中量制备试剂盒为德国Ｑｉａｇｅｎ公司产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。
电击转化缓冲液Ⅰ含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６００ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ＬＬｉＡｃ，用于不含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液Ⅱ含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６００ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ＬＬｉＡｃ、３００ｇ／Ｌ聚乙二醇４０００，用于含聚乙二醇４０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液Ⅲ含有１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２７０ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ｍｍｏｌ／ＬＬｉＡｃ，用于萌发孢子的电击转化。
ＳＴＣ溶液含有１ｍｏｌ／Ｌ山梨醇、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，ＰＴＣ溶液含有４００ｇ／Ｌ聚乙二醇４０００、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２。
１．２方法１．２．１原生质体的制备参考文献［19］。
菌株Ｍ７５７７在产孢培养基上于３０℃培养７～１０ｄ，收集孢子并制备成均一的浓度为１×１０８～１×１０９个／ｍＬ的孢子悬液。
取２００μＬ孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的ＰＤＡ平板上，于３０℃培养３０ｈ，收集菌丝体，用１ｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４溶液洗１次。
约３００ｍｇ菌丝体加３０ｍＬ裂解酶液，于３０℃以６０ｒ／ｍｉｎ酶解２～３ｈ，过滤，滤液于４℃、以３２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。
弃上清，用１．２ｍｏｌ／Ｌ预冷的山梨醇溶液洗原生质体沉淀２次，分为２份。
一份重悬于１．２ｍｏｌ／Ｌ预冷的山梨醇溶液中，一份用预冷的ＳＴＣ溶液洗１次。
两份样品均置于冰浴备用。
１．２．２质粒的线性化用ＨｉｎｄⅢ酶切线性化质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ。
酶切反应体系：３６μＬ１０×ＥｎｚｙｍｅＢｕｆｆｅｒ，２０μｇｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ，１２μＬ１０Ｕ／μＬＨｉｎｄⅢ，加ｄｄＨ２Ｏ至３６０μＬ，置于３７℃水浴２～４ｈ，于６５℃水浴反应１５ｍｉｎ，停止反应，然后分为２份，一份备用，称为质粒Ａ液；另一份用苯酚－氯仿抽提纯化，然后溶解于无菌去离子水，称为质粒Ｂ液。
１．２．３ＲＥＭＩ技术的转化方法参考文献［20］。
用预冷的ＳＴＣ溶液洗原生质体并再重悬，浓度调整至５×１０７个／ｍＬ。
取１００μＬ转化用原生质体液，加入１μｇ环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ，轻轻吹吸混匀；分别加限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ ３０～１９０Ｕ，冰浴３０ｍｉｎ，加１ｍＬＰＴＣ，于室温静置４０～６０ｍｉｎ，涂布于含有１２０μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布２００μＬ转化液。
于３０℃暗培养４～５ｄ，统计转化子数。
１．２．４最适质粒的选择采用３个启动子序列来源不同的环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１，用量为７５或１０５Ｕ的限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＳａｃⅠ、ＢａｍＨⅠ，将１μｇ不同质粒和限制性内切酶分别加到１００μＬ５×１０７个／ｍＬ原生质体中，对红曲霉进行转化试验，以潮霉素B抗性转化子数为指标评价和筛选适合转化红曲霉的质粒。
１．２．５最适限制性内切酶的选择选择７种不同的限制性内切酶为转化质粒，其中平末端酶有ＳｍａⅠ和ＨｐａⅠ，５′端突出末端酶有ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌⅠ和ＥｃｏＲⅠ，３′端突出末端酶有ＫｐｎⅠ、ＳａｃⅠ，向１００μＬ５×１０６个／ｍＬ原生质体液中加入１μｇ线性或环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和７５Ｕ限制性内切酶进行转化试验，以不加酶处理的作对照，以潮霉素B抗性转化子数为指标评价和筛选合适的限制性内切酶。
１．２．６酶切缓冲液对转化的影响试验有７种试验方案，１００μＬ原生质体液中，①加质粒Ａ液和１０５ＵＨｉｎｄⅢ，②加质粒Ｂ液、１０５ＵＨｉｎｄⅢ和10×酶切缓冲液，③加质粒Ｂ液和１０５ＵＨｉｎｄⅢ，④加环状质粒、１０５ＵＨｉｎｄⅢ和10×酶切缓冲液，⑤加环状质粒和１０５ＵＨｉｎｄⅢ，⑥加质粒Ｂ液，⑦加环状质粒作为对照。
然后轻轻吹吸混匀，冰浴３０ｍｉｎ，加１ｍＬＰＴＣ溶液，于室温静置４０～６０ｍｉｎ。
取转化液涂布于含有１２０μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布２００μＬ，于３０℃暗培养４～５ｄ，统计潮霉素B抗性转化子数。
１．２．７最适原生质体浓度的选择将８μｇ质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和１０５Ｕ限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ分别加入１００μＬ浓度分别为１．０×１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、１．０×１０８、１．５×１０８个／ｍＬ原生质体中进行转化试验。
以潮霉素B抗性转化子数为指标确定适合转化的红曲霉原生质体浓度。
１．２．８最适ＨｉｎｄⅢ用量的选择在１００μＬ含有８μｇ环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ的５×１０７个／ｍＬ原生质体中分别加入0、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、１９０ＵＨｉｎｄⅢ进行转化试验。
以潮霉素B抗性转化子数为指标确定最适合转化的ＨｉｎｄⅢ用量。
１．２．９最适质粒用量的选择在１００μＬ含有１００ＵＨｉｎｄⅢ的５×１０７个／ｍＬ原生质体中分别加入１、２、４、８、１６μｇ质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ进行转化试验。
以潮霉素B抗性转化子数为指标确定最适合红曲霉转化的质粒用量。
２结果与分析２．１最适质粒的选择结果为了探讨不同构建方法得到的质粒对红曲霉转化的影响，试验中用了３个启动子序列来源不同的质粒进行转化（质粒均未线性化），试验中环状质粒用量为１μｇ，原生质体浓度为５×１０７个／ｍＬ。
由表１可知，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ对红曲霉的转化率非常高，转化子达（２６７９±８）个／μｇ；ｐＣＢ１００３次之；ｐＡＮ７－１的转化率最差，仅为15～４1个／μｇ。