高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化
优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究
第25卷第2期 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 Vol.25,No.2 2009年3月 Journal of Qiqihar University March,2009优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究王世伟1，李旭业2，张伟伟1（1. 齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔161006；2. 黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔161005）摘要：通过研究不同生长状态、处理溶液、保存时间及热激时间对感受态细胞制备的影响，分析了影响大肠杆菌株JM109和DH5α感受态细胞形成因素，优化了制备感受态细胞的方法。
结果表明，OD 600为0.43的大肠杆菌菌液经处理液（20 mmol/L MgCl 2 + 80 mmol/L CaCl 2）处理，-85℃放置12～14 h，42℃热激处理90 s，转化效率最高，可达5.5×105～6×105cfu/µg DNA（pSilencer2.1-U6-neo），随着质粒放置时间增加，转化效率下降。
关键词：感受态细胞；制备方法；转化效率中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：1007-984X(2009)02-0086-05质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli ）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[1]，是基因克隆以及DNA 文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。
一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器，而利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞，操作方便、应用广泛，但是氯化钙法在实际操作中的转化效率常常不能完全满足试验的要求。
目前，实验室中常用的感受态细胞多为公司直接提供的，其价格昂贵，不适于普通基因克隆操作中的频繁使用[2，3]。
因此，对感受态细胞制备方法进行合理优化是提高转化效率的关键。
1 材料与方法1.1 菌种与质粒大肠杆菌（Escherichia coli ）DH5α由齐齐哈尔大学分子生物学实验室保存，含pSilencer2.1-U6-neo 质粒；大肠杆菌JM109由黑龙江大学分子生物学实验室赠送。
感受态细胞的制备和转化
感受态细胞的制备和转化或者：设计好实验项⽬，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加⽆菌⽔⾄150µL（不超过200µL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的⽬的是计算转化率）；对其余各项，分别各取⼀半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。
倒置平板，37℃培养12-14⼩时。
⼀般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌⽐⽆活性酶的细菌⽣长慢，故过夜培养后可见到毫⽶⼤⼩的阳性⽩⾊菌落⽽阴性的兰⾊菌落只有针尖⼤⼩。
5. 将上述菌液摇匀后取100µl 涂布于含Amp的筛选平板上，正⾯向上放置半⼩时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养⽫，37℃培养16-24⼩时。
6. 计算转化率，统计每个培养⽫中的菌落数。
转化后在含抗⽣素的平板上长出的菌落即为转化⼦,根据此⽫中的菌落数可计算出转化⼦总数和转化频率,公式如下：转化⼦总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化⼦数／每mg质粒DNA）＝转化⼦总数／质粒DNA加⼊量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化⼦总数／感受态细胞总数[注意] 本实验⽅法也适⽤于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不⼀定⼀样。
有的转化效率⾼,需将转化液进⾏多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,⽽有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离⼼),才能较准确的计算转化率。
第四节注意事项与提⽰1. 倒平板时应避免培养基温度过⾼，若温度过⾼，则加⼊的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表⾯及⽫盖会形成⼤量冷凝⽔，易于造成污染及影响单菌落的形成。
若⽤⼿掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。
制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个⽉，时间过长氨苄青霉素将会失效。
JM109,DH5a,BL21等感受态细菌特点及应用
1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株BL21菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4：JM109菌株JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG6：HB101菌株HB101菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1。
超级感受态细胞的制备方法
制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有前述菌株的1/10-1/5。
尽管如此，实际上对所有克隆方面的用途来说，这已绰绰有余。
一些大肠杆菌菌株（如ＭＣ1061）不适于此法。
下列有３个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：（１）转化缓冲液中试剂的纯度务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光保存于冷处。
（２）细胞的生长状态由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70┴冰冻培养基中的贮存原种接种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于４℃或贮存于室温的培养物。
（３）玻璃和塑料器皿的清洁度痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的生长效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。
这些玻璃器皿应用手洗刷，再灌满纯水（Ｍilli-Ｑ级或与其相当的级别），然后高压灭菌，临用前方把水倒掉。
细心操作的话，几乎总是可以获得转化效率高的感受态细胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108个转化菌落。
然而甚至经验最为丰富的工作者也不可能保证，有必要用标准的螺旋质粒ＤＮＡ制品来检测每一批新的感受态细胞的转化效率。
制备感受态细胞前，先制备一大批的螺旋质粒ＤＮＡ，分装成许多小份贮存于-70℃。
这些标准制品可用来检验每一批新的感受态细胞的转化效率，并检查每一个实验的转化效率。
设立这样一个阳性对照后，如果某一次实验得不到转化菌落，就可以根据对照的情况查明宣究竟是感受态细菌方面有庇漏，还是ＤＮＡ制品间有差异。
分装的感受态细菌可在-70℃保存几个月而转效率无明显下降。
１）用无菌铂丝直接蘸取冻存有大肠杆菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原种）（贮存于-70℃的冻培养基上，见附录Ａ），在SOB琼脂平板表面划线，于37℃培养16小时。
高效JM109感受态细胞使用方法
JM109感受态细胞JM109：10×100μlpUC19（control vector）：10pg/μl10μl保存条件：-80℃JM109感受态细胞介绍: JM109感受态细胞是采用大肠杆菌JM109菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。
使用pUC19质粒检测，转化效率可达108，-70℃保存几个月转化效率不发生改变。
recA1和endA1突变阻止对克隆DNA的修饰或对宿主菌染色DNA的重组，提高纯化质粒的产量和质量。
储运-70 ℃保存，避免反复冻融产品概述JM109 菌株的基因型为：endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17(rk-mk+) relA1 supE44 D(lac-proAB) [F’ traD36 proAB laqlqZ Δ M15]产品简介JM109感受态细胞是采用大肠杆菌JM109菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA 的化学转化。
使用pUC19 质粒检测，转化效率可达10 8 ，－70 ℃保存几个月转化效率不发生改变。
每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。
质量稳定，使用方便，质优价廉。
recA1和endA1突变阻止对克隆DNA的修饰或对宿主菌染色DNA的重组，提高纯化质粒的产量和质量。
操作方法1. 取100μl冰上融化的JM109感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物）并轻轻混匀，冰上静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基（2YT或LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
注意事项1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
高效转化及感受态细胞的制备
关于感受态细胞及转化克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。
我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。
实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。
生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。
Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。
XL10-Gold®用途包括：--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。
Hte 基因型Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb 连接DNA的克隆。
XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。
超级感受态细胞Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。
电转化感受态细胞Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。
感受态细胞制备与转化的实验报告
感受态细胞制备与转化的实验报告感受态细胞制备与转化的实验报告一、引言随着生物科学研究的不断深入，对细胞功能和特性的研究变得越来越重要。
而传统上，研究者通常将细胞分类为基因编码的外显性细胞和感受态细胞。
感受态细胞是具有特定功能和响应能力的细胞，这使得它们在医学和生物学领域的应用潜力广阔。
本实验旨在探索感受态细胞的制备和转化方法，并评估其在功能研究中的应用潜力。
二、方法1. 感受态细胞制备a) 实验人员通过文献调研和现有技术，确定适合本次实验的感受态细胞类型和制备方法。
b) 选取合适的细胞系，如神经元细胞系或免疫细胞系，根据文献中的描述，采用合适的制备方法。
c) 在细胞培养基中加入适当的因子或化合物，以诱导细胞进入感受态。
d) 筛选并分离感受态细胞，使用细胞培养技术将其扩增至足够数量。
2. 感受态细胞转化a) 收集适当的转化因子或刺激物，根据研究目的确定转化条件。
b) 使用合适的技术和试剂将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
c) 对转化后的细胞进行验证和鉴定，确保其已成功转化。
三、结果与讨论1. 感受态细胞制备经过感受态细胞制备的过程，实验人员成功获得了目标细胞系的感受态细胞。
通过适当的因子或化合物的处理，细胞成功转变为特定的感受态细胞，显示出对特定刺激的响应能力。
这为后续的实验和应用提供了良好的基础。
2. 感受态细胞转化通过合适的转化因子或刺激物处理，实验人员将感受态细胞转化为所需的细胞类型。
转化后的细胞具备了目标细胞的特征和功能，通过验证和鉴定，确保转化的成功率和质量。
这为进一步研究不同细胞类型的功能和应用提供了可能。
感受态细胞的制备和转化是一项重要的技术，在生物医学研究和应用中具有广泛的潜力。
通过实验人员的努力，成功制备和转化了感受态细胞，为相关领域的研究提供了强有力的支持。
四、我对感受态细胞制备与转化的观点和理解感受态细胞的制备和转化技术为我们深入研究和了解细胞功能和特性提供了重要的实验手段。
JM109感受态的制备与转化
【材料 】
重组质粒及空载体质粒，JM109大肠杆菌感受态 细胞 ，1.5ml塑料离心管，离心管架，1-10 ul、 1000 ul、200ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜 （0.22um），大量碎冰
方法2 PEG介导的感受态细胞制备
【材料 】
重组质粒PUC-U6及空载体质粒PUC119， JM109大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架， 1-10 ul、1000 ul、200ul枪头，9cm培养皿，一 次性滤器（0.22um），大量碎冰
【设备 】
微量移液器(2μl,200μl,1000μl)，高压蒸汽消 毒器(灭菌锅)，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇 床，离心机， 超净工作台，双蒸水器，冰箱， 制冰机等。
E.COLI JM109感受态细胞的制备与转化
1.目的（1）掌握大肠杆菌感受态细胞的原理 和方法
（2）掌握制备大肠杆菌感受态细胞的
操作方法
实验原理:
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感 受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。目前常用的感 受可态以细满胞 足制 一备 般方 实法验有的C要a求Cl2,制法备，出简的便感易受行态,且细其胞转暂化时效不率用完时全, 可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此 C细时a菌CCal2处2法+使于为细0使℃胞用的膜更C磷a广C脂l泛2低层。渗形C溶a成C液l液2法中晶制，结备菌构感体，受细使态胞位细膨于胞胀外的成膜原球和理形内是，膜：同间 隙中的部分核酸酶解离，诱导形成感受态细胞。待转化 DNA和Ca2+形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物粘附于细胞 表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经 42℃短时间热激处理，细菌细胞膜的液晶结构发生改变， 出现许多间隙，通透性增加，促进细胞吸收DNA复合物。 在营养丰富的培养基上生长数小时后，受体细菌分裂增殖， 被转化到细菌细胞中的重组子基因得到表达，在选择性培 养基平板上，可筛选出所需的阳性转化子。
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高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化摘要：采用不同的转化液制备大肠杆菌（Escherichia coli）JM109感受态细胞，并进行pUC18质粒的转化，考察细菌生长状态、转化液、转化的热激时间和转化后所用培养基对转化率的影响。
结果表明，菌液A600 nm为0.705时采用TB转化液制备感受态细胞，在42 ℃热激45 s，转化后采用SOC培养基振荡培养，转化效率最高，可达8.59×108 CFU/μg质粒。
关键词：JM109；感受态细胞；转化效率Preparation and Transformation Conditions for Efficient JM109 Competent CellsAbstract：Competent cells of Escherichia coli JM109 were prepared by different transformation liquid，and pUC18 was transformed into the competent cells. The effects of different growth state of bacteria，transformation liquid，heat shock time and culture medium after heat shock on transformation efficiency were studied. The results showed that the highest transformation rate could be obtained by preparing the competent cells by TB transformation liquid when bacteria A600 nm was 0.705，heat shocked at 42 ℃for 45 s and then culturing in SOC medium. The transformation efficiency could reach to 8.59×108 CFU/μg plasmid.Key words：JM109；competent cell；transformation efficiency在自然条件下很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，而人工构建的质粒载体一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移；如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
将大肠杆菌受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、化学试剂法等）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competent cell）[1]。
不同的大肠杆菌菌株制备感受态时所要求的菌体密度不同[2]，本研究利用不同的转化液将大肠杆菌（Escherichia coli）JM109菌株制备成感受态细胞，进行pUC18质粒的转化，考察热激时间和培养基对转化率的影响，优化转化条件，旨在为感受态的制备提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌种和质粒Escherichia coli JM109菌株由山东博奥克生物科技有限公司研发中心提供；pUC18质粒为该研发中心实验室保存。
1.1.2 主要试剂及仪器KCl、NaCl、CaCl2、Pipes、MnCl2、MgCl2等试剂均为分析纯，购自Sigma公司；酵母粉、胰蛋白胨购自美国Oxoid公司。
主要仪器有高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、数显恒温水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公司）、立式压力蒸气灭菌器（上海新诺仪器设备有限公司）、紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、超净工作台（北京德天佑科技发展有限公司）、电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团）等。
1.1.3 培养基及溶液的配制①LB培养基。
胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g，加入950 mL去离子水，用5 mol/L NaOH调pH至7.0，定容至1 L，121 ℃高压蒸气灭菌20 min。
②SOB培养基。
胰蛋白胨20 g、酵母提取物5 g、氯化钠0.5 g、1 mol/L氯化钾2.5 mL，加入去离子水充分溶解后定容至1 L。
分成100 mL的小份，高压灭菌。
培养基冷却至室温后再在每小份中加1 mL灭过菌的1 mol/L氯化镁（用0.22 μm的滤膜过滤除菌）。
③SOC培养基。
每100 mL SOB培养基中加2 mL灭菌的1 mol/L葡萄糖。
④TB转化液。
0.760 g Pipes、0.816 g CaCl2、1.660 g KCl加入去离子水230 mL，用KOH调pH至7.0后过滤除菌，4 ℃保存。
⑤100 mg/mL氨苄青霉素。
称取1 g氨苄青霉素，加入去离子水溶解后定容至10 mL，过滤除菌，-20 ℃保存。
1.2 实验方法1.2.1 细菌生长状态及转化液对感受态细胞转化率的影响取-70 ℃保存的JM109菌种划线于无氨苄青霉素的LB平板，37 ℃倒置培养过夜，挑单菌落37 ℃振荡培养过夜。
第2天按1%的接种量接种于LB培养基中，振荡培养至A600 nm分别为0.30±0.02、0.40±0.02、0.50±0.02、0.60±0.02、0.70±0.02、0.80±0.02、0.90±0.02、1.00±0.02时各取50 mL菌液，4 ℃、4 500 r/min离心10 min，每个处理两管，1号管加入10 mL 0.1 mol/L预冷的CaCl2溶液，2号管加入10 mL TB 转化液，重悬细胞，冰浴30 min，4 ℃、4 500 r/min离心5 min收集细胞，轻轻悬浮细胞（1号管加入1 mL 0.1 mol/L预冷的含15%甘油的CaCl2溶液，2号管加入含10% DMSO的TB转化液），冰上放置几分钟即成感受态细胞悬液，分装后-70 ℃保存备用。
用0.01 ng的pUC18质粒转化100 μL感受态细胞，冰上放置30 min，42 ℃热激30～90 s，再在冰上放置2 min，加入400 μL无氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，取适当菌液涂至含有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜，2 d后观察菌落的数量。
转化率（CFU/μg）=■1.2.2 热激时间对感受态细胞转化率的影响按“1.2.1”确定的优化方案制备JM109感受态细胞，加入0.01 ng pUC18质粒，冰浴30 min，42 ℃分别热激15、25、35、45、55、65、75、85 s后置于冰上2 min，加入400 μL无氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，涂适量菌液至含有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃倒置培养过夜，计数并计算转化率。
1.2.3 转化后所用的培养基对感受态细胞转化率的影响按“1.2.2”优化的条件转化大肠杆菌感受态细胞，分别加入400 μL无氨苄青霉素的LB培养基、SOC培养基，37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，涂适量菌液至相应含有氨苄青霉素的平板培养基，37 ℃倒置培养过夜，计数并计算转化率。
2 结果与分析2.1 细菌生长状态及转化液对感受态细胞转化率的影响摇菌过程分别在JM109菌液的A600 nm为0.302、0.417、0.486、0.611、0.705、0.794、0.913、1.016时取样，用CaCl2和TB转化液两种方法制备感受态细胞，质粒pUC18的转化率结果见表1。
由表1可知，相同的菌液浓度条件下，以TB 转化液制备的JM109感受态细胞转化率远远高于以CaCl2溶液制备的感受态细胞，且转化率随菌液A600 nm的升高均呈先升高后下降的变化趋势。
菌液A600 nm为0.705时采用TB转化液制成的感受态细胞转化率最高，极显著高于其他处理（P<0.01）。
菌液浓度过低，大肠杆菌细胞总量很少，制成感受态细胞时接受外源DNA的能力有限，因而转化率较低；但菌液浓度过高，大肠杆菌处于生长平台后期，细胞活力下降，也会导致转化率较低。
低温（0 ℃）CaCl2溶液中，Ca2+会使细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物[3]。
此时将该体系转移到42 ℃下作短暂的热激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收[3]。
Ca2+处理的感受态细胞转化率一般能达到5×106～2×107 CFU/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。
如在Ca2+的基础上联合其他的金属离子（如K+、Mn2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1 000倍[4-8]，因此其他条件相同时TB转化液制得的感受态细胞转化率比CaCl2溶液制得的高许多。
2.2 热激时间对感受态细胞转化率的影响培养JM109菌液至A600 nm约为0.7，采用TB转化液制备感受态细胞，在42 ℃分别热激15、25、35、45、55、65、75、85 s，转化率如图1所示。
由图1可知，转化率先随着热激时间的延长而迅速升高，到45 s时转化率最高，为2.64×108 CFU/μg，之后再延长热激时间，转化率有所降低。
热激时间过短，细胞膜上出现的间隙少，不利于外源DNA进入，但热激时间过长会导致细胞死亡。
2.3 转化后所用培养基对感受态细胞转化率的影响按优化的条件制备感受态细胞并进行质粒转化，分别在无氨苄青霉素的LB 培养基和SOC培养基中培养1 h，涂适量菌液至相应含有氨苄青霉素的平板培养基，37 ℃倒置培养过夜。
菌落计数和计算结果表明，LB培养基中感受态细胞转化率为4.27×108 CFU/μg，SOC培养基中感受态细胞转化率为8.59×108 CFU/μg，二者之间的差异达极显著水平。
这可能是因为SOC培养基比LB培养基具有更丰富的营养，质粒转进菌体内后菌体复苏快，利于菌体生长增殖，转化率较高。
3 小结与讨论大肠杆菌感受态细胞的转化效率受很多因素的影响，其中之一就是细菌细胞必须处于对数生长早期，由生长过度或发育不全的细菌制备的感受态细胞转化效率较低。
另外一个重要的因素是Ca2+，Ca2+能与细胞膜形成复合物PHP/Ca以利于外源DNA的渗入，本实验结果表明用K+、Pipes与Ca2+按一定比例搭配使用制作感受态细胞时，其转化效率优于单纯使用Ca2+[1，2]。