酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化
《酶固定化和修饰》PPT课件
缺点 结合力弱，对pH、离子强 度、温度等因素敏感，酶 易脱落，酶的装载容量较 小 偶联条件激烈，易引起酶 失活；成本高
交联条件激烈，机械性能 差
仅可用于低分子量的底物
固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶 的不足之处，具有如下显著的优点： （1）酶的稳定性增加，减少温度、pH值、有机溶剂 和其他外界因素对酶的活力的影响，可以较长期地 保持较高的酶活力。 （2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提 高酶的利用价值，降低生产成本。 （3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的 分离纯化，从而提高产品质量。
低； —大多数情况下可以提高酶的稳定性； —可以增加产物的收率，提高产物质量； —有利于实现管道化、连续化以及自动化
操作，易于与各种分离手段联用。
固定化酶的缺点
• 但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶 的活力难免有一定损失；
• 而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应； • 也不适宜于需要辅助因子的反应。 • 胞内酶必须经过酶的分离过程
• 固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项技术
• 1969年固定化氨基酸酸化酶在工业生产中被正式应用
• 1971年的第一届国际酶工程会议上，正式 采用固定化酶（immobilized enzyme）
固定化酶的优点
• 优点： —易于将酶与底物及产物分离，因而产物
相对容易提纯； — 酶能够重复利用，使用效率提高，成本
由必需基团构成的与酶催化活性有关的 特定区域.
非必需基团
酶
非活性中心
分
子
活性中心外
必需基团
必需基团
结合基团 活
活性中心
性
酪氨酸酶的固定化及其对水中酚类物质的去除
酪氨酸酶的固定化及其对水中酚类物质的去除摘要本文制备了不同质量比的壳聚糖/有机累托石插层复合物（CTS/OREC），并以CTS/OREC为载体通过吸附法和交联法固定酪氨酸酶。
结果表明，吸附法固定化酶（A-TYR）的最佳条件为以壳聚糖/有机累托石质量比4:1的插层复合物为载体，pH值5.0，酶与载体质量比30 mg/g，固定化时间6h，制备得固定化酪氨酸酶的载酶量为17.30mg/g，单位载体酶活为11.67kU/g，酶活回收率87.9%；戊二醛交联法固定化酶（C-TYR）的最佳条件为以壳聚糖/有机累托石质量比为4:1的插层复合物为载体，pH值4.0，酶与载体质量比30 mg/g，固定化时间4 h，制备得固定化酪氨酸酶的载酶量为26.52mg/g，单位载体酶活为6.14kU/g，酶活回收率29.7%。
固定化酶比游离酶有更好的操作稳定性和储存稳定性。
4℃储存20天后A-TYR相对酶活为63.9%，C-TYR相对酶活为89.6%。
A-TYR去除苯酚的最佳反应条件为pH 7.0、温度40℃；A-TYR去除4-氯酚的最佳反应条件为pH 5.0、温度30℃；A-TYR去除2,4-二氯酚的最佳反应条件为pH 6.0、温度30℃。
A-TYR在最佳条件下完全去除苯酚、4-氯酚和2,4-二氯酚时的最佳酶与底物质量比分别为3.50mg/mg、1.38mg/mg、1.38mg/mg。
关键词：酪氨酸酶；固定化；壳聚糖；累托石；插层复合物；酚Immobilization of tyrosinase and removal of phenoliccompounds in waterAbstractIn this paper, different mass ratio of chitosan (CTS) and organic rectorite (OREC)was used to prepared intercalation composite(CTS/OREC) and CTS/ORECwith mass ratio of 4:1 was used as a carrier to immobilize tyrosinase through adsorption and cross-linking method. The optimal immobilization condition of tyrosinase for adsorption (A-TYR)was pH5, the mass ratio of enzyme to support 30 mg/g, immobilization time 6 h. In this condition, the protein loading yield of A-TYRwas 17.30mg/g, enzyme activity of the unit support 11.67kU/g, and activityrecovery 87.9%. The optimal immobilization condition of tyrosinase for glutaraldehyde cross-linking (C-TYR)was pH4, the mass ratio of enzyme to support 30 mg/g, immobilization time 4 h. In this condition, the protein loading yield of C-TYR was26.52mg/g,enzyme activity of the unit support 6.14kU/g, and activity recovery 29.7%. The immobilized tyrosinase retained higher relative activity when the temperature and pH value changed, compared with the free enzyme. The immobilized tyrosinase have batter storage stability than the free enzyme, the A-TYRand C-TYR still retained 63.9%and 89.6%relative activity, respectively,even after 20 days stored in 4℃. A-TYR was used to removephenol, 4-chlorophenoland 2,4–dichlorophenol, the removal ratio can reach 100% when the mass ratio of enzyme to substrate is 3.50mg/mg,1.38mg/mg,1.38mg/mg, respectively.Key words: tyrosinase; immobilization; chitosan; rectorite; intercalation composite material; phenolic compounds目录1.前言1.1酚类化合物的性质 (1)1.2酚类化合物的处理方法 (1)2.实验材料及方法2.1 实验试剂 (3)2.2 实验仪器 (3)2.3 累托石的有机化 (3)2.4 壳聚糖/有机累托石插层复合物的制备 (3)2.5 壳聚糖/有机累托石插层复合物的结构表征 (4)2.6 酪氨酸酶的固定化 (4)2.6.1 吸附法 (4)2.6.2 交联法 (4)2.7 酪氨酸酶活性的测定 (4)2.7.1酶活单位及相对酶活的定义 (4)2.7.2酶活回收率及载酶量的测定 (5)2.8 酚的去除 (5)3.结果与讨论3.1壳聚糖/有机累托石插层复合材料的结构表征 (6)3.2酪氨酸酶的固定化 (8)3.2.1正交试验 (8)3.2.2单因素筛选 (10)3.2.3 酪氨酸酶固定化的最佳条件及固定化酶活力参数 (13)3.2.4 固定化酪氨酸酶的性质 (14)3.3酚的去除 (20)3.3.1 正交试验 (20)3.3.2单因素对酚的去除的影响 (21)3.3.3 A-TYR对酚去除的重复使用性 (24)4.结论 (25)5.不足与展望 (26)6.参考文献 (27)7.致谢 (29)1.前言1.1酚类化合物的性质酚是十分重要的化工原料之一，在炼油、焦化、印染、制药等产业中有着广泛的应用。
E.coli M15(pQTPL)高效发酵生产酪氨酸酚裂解酶的控制策略
摘 要：在摇瓶和 ４Ｌ发酵罐上研 究了营养 和环 境条件对 重组菌 Ｅ ｃｌＭ １ ｐ Ｔ Ｌ分批发酵生产酪氨酸酚裂解酶 ． ｏ ５（ Ｐ ） ｉ Ｑ （Ｐ １ Ｔ Ｌ 的影 响．在培养基 中添加 ２ ／ ０ｇＬ葡萄糖和 １ ／ ． ｇＬ玉米浆使 Ｔ Ｌ酶活提 高到 ６ ． Ｗ ｇ干 重） 在此基础上 ，维持 ０ Ｐ ３１ （ ． 发酵液中溶氧水平 为 ３ ％， ０ 可使菌 体浓度 在 ８ ｈ达到 ４７ ／ 酶活为 ５ ．Ｕ／， ．８ Ｌ， ｇ ４６ ｇ 比对照组（ 不控制溶氧） 别提 高了 ２ ％ 分 １ 和 ３ ．％． １ ６ 采用溶氧反馈调节一 限制性补料策略 ，可使菌体浓度提 高到 ３ ． ｇＬ １ ／ ．采用两阶段温度和 ｐ ５ Ｈ控制策略 ，在 发酵前 ８ 制 ｐ ．、温度 ３ ｈ控 Ｈ ７０ ７℃，８ｈ至发酵结束之 间控制 ｐ Ｈ为 ８０ ．、温度为 ３ ℃，可使重组菌的 Ｔ Ｌ酶活达 到 ０ Ｐ １４ ／，并使 Ｔ Ｌ在细胞 中过量表达 ，实现 了高菌体浓度和 高 Ｔ Ｌ酶活 的统一． ５．Ｕｇ ４ Ｐ Ｐ 关键 词：Ｅ ｃ ｌＭ１ （Ｑ Ｐ ） ．ｏｉ ５ ｐ Ｔ Ｌ ；酪氨酸酚裂 解酶；高效生产
２ ２ 培养基 ． 种 子培养 基（／） ｇ ：蛋 白胨 １ ，酵 母粉 ５ ａ １ ０ Ｌ ０ ，Ｎ Ｃ ， １
大． ． Ｏ Ａ 主要 由微生物酶法合成 ，即以邻苯二酚 、 ＬＤ Ｐ
丙酮酸 和氨为 底物 ，磷 酸吡 哆醛 （ｙｉ ｘ ｌＰ ｏｐ ａ ， Ｐ ｒ ｏ ａ ｈ ｓｈｔ ｄ ｅ Ｐ Ｐ为辅酶，在酪 氨酸酚裂解 酶（ｙｏｉ ｈｎ ｌ ｙｓ， Ｌ） Ｔ ｒｓ ｅＰ ｅｏ ａｅ ｎ Ｌ Ｔ Ｌ ．．４１ ９ ） 作用 下催 化 合 成 ［ １ 为 合 成 Ｐ ，ＥＣ ．． ． 的 ９２ ３ ．作 ， ４ ＬＤ Ａ 的关键酶 ，Ｔ Ｌ的氨基酸组成 、酶学性质 、酶 ． ＯＰ Ｐ
琼脂包埋法固定化酪氨酸酶的研究
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高密度发酵产酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPA
高密度发酵产酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPAXU Bingbing;LEI Qingzi;ZENG Weizhu;WEI Yanan;HUANG Kefeng;ZHOU Jingwen【摘要】为了提高酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)的表达量和酶活,使之更高效地催化合成左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine,L-DOPA),在摇瓶优化的基础上,研究了溶氧控制策略、补料策略、诱导温度和诱导策略对菌体生长、TPL酶活和L-DOPA产量的影响.结果表明,在5L发酵罐中25℃诱导条件下,采用DO-stat补料策略控制罐内溶氧的体积分数为20％,菌体浓度、TPL酶活和催化合成L-DOPA产量较分批培养分别提高了17.9％、57.7％和27.8％.诱导后控制溶氧体积分数在40％相比于20％更利于TPL的表达,酶活相比于20％的DO的提高了33.8％.通过优化起始诱导时间,在菌体生长的对数前期(OD600=7)诱导,细胞浓度提高到51.2 g/L,酶活提高到2.43 U/mL,L-DOPA产量为56.58 g/L,较分批培养分别提高了64.1％、170％和209.2％.初步实现了重组大肠杆菌高密度培养生产TPL,为L-DOPA产业化研究奠定了基础.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)012【总页数】8页(P7-14)【关键词】酪氨酸酚裂解酶;L-DOPA;溶氧;DO-start;诱导策略【作者】XU Bingbing;LEI Qingzi;ZENG Weizhu;WEI Yanan;HUANG Kefeng;ZHOU Jingwen【作者单位】;;;;;【正文语种】中文左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine，L-DOPA)，又名3-羟基-L-酪氨酸，是一种前体药物，可通过血脑屏障进入脑循环而达中枢神经系统，在脱羧酶的作用下转变为多巴胺，从而达到治疗帕金森综合症的效果[1]。
酪氨酸酚裂解酶改造强化全细胞催化合成左旋多巴
酪氨酸酚裂解酶改造强化全细胞催化合成左旋多巴左旋多巴（3,4-2dihydroxylphenylalanine,L-DOPA）是治疗帕金森综合症的主要药物,随着我国人口老龄化速度的加快,对左旋多巴的需求也迅速增加。
目前应用于工业化生产L-DOPA的方法主有化学合成和微生物酶催化法。
化学合成法虽然具有纯度高和收率高的优势,但也存在步骤繁杂、环境污染严重、成本较高等问题;微生物酶催化法具有工艺简单、产量稳定、条件温和等优点,具有广阔的工业化应用前景。
原始菌株（如Erwinia herbicola等）中的酪氨酸酚裂解酶（Tyrosine phenol-lyase,TPL）活性普遍较低,无法直接用于高效催化合成L-DOPA。
为了提高酪氨酸酚裂解酶表达量与酶活,本研究在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达来源于草生欧文式菌（Erwinia herbicola）的TPL,通过易错PCR技术对酪氨酸酚裂解酶基因进行定向进化,并分别在摇瓶和5 L发酵罐水平上对重组菌的培养条件以及催化合成L-DOPA的条件进行了优化,提高了酪氨酸酚裂解酶的催化效率和L-DOPA的产量。
论文主要研究结果如下:（1）结合易错PCR和高通量筛选技术定向进化酪氨酸酚裂解酶,强化TPL催化活性,并分析突变体酶学性质。
首先对易错PCR的条件进行了优化,确定了Mg<sup>2+</sup>和Mn<sup>2+</sup>的最适添加浓度,平均突变率为0.5%。
经两轮易错PCR和高通量筛选,从大约2×10<sup>4</sup>个突变体中筛选获得了一株正向突变株3-2F9。
经全细胞催化,L-DOPA产量较原始菌株提高了36.5%。
通过测定突变TPL的酶学性质,得到其最适反应温度为30<sup>o</sup>C,最适pH为9.0。
L-酪氨酸纯化工艺的优化
中 图分 类 号 ： ５３ Ｑ Ｏ 文献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０６—８７ （ｏｏ ｏ ０８ ０ １０ ３ ６ ２ ｌ ）３— ０ ０－ ３
Ｌ一酪氨酸 （ Ｌ—Ｔ ｒｓ ｅ 是 一种 重 要 的生 化试 ｙｏｉ ） ｎ
为０ ．５—１ ０ 将 溶液 加 温至 ８ ￣ 加 入 ３ ３糖 用 活 ．， ０Ｃ， ０
３ １ 按照 试验 方法 ２ ２ １ 对 Ｌ一酪氨 酸粗 品（Ｉ） ． ．． ， 进行 了两 组对 比试 验 。每组 试 验 重 复 ４次 ， 测 出 共
性 炭后 搅拌 脱色 ４ ｎ 测定 脱色 液 的透过率 ， ０ｍｉ， 当滤 液 的透 过率 （ ） 到 ９ ． ％ 以上 时 过 滤 ； 制 滤 液 Ｔ达 ８０ 控
出高纯度的酪氨酸非常困难 。若采用传统的分离方 法， 不仅 费工 费 时 ， 成 原 辅 料 的消 耗 和 产 品 的 流 造
失， 而且 分离效 果并不 理想 ， 所得 到 的 Ｌ一酪 氨酸 产
碱 溶ｐ ｔ５
Ｌ・ Ｔｙ （Ｉ） ｒ
优 化 的 Ｌ一酪 氨 酸 生产 工 艺 路 线及 参 数 ， 图 见
品 的 比旋光 度和透 过 率 两项 指 标 较低 ， 品质 量 产
较 难达标 ， 而 限制 了产 品 的销 售 和 经济 效 益 。本 从
剂， 是合 成 多 肽类 激 素 、 生 素 、 抗 Ｌ一多 巴 等 药物 的 主要 原料 ， 广泛 地应 用 于 医 药 、 品添 加 剂 、 物化 食 生 工 和饲料 等领域 ， 医 药上 能用 作 甲状 腺 功 能亢 进 在 症 治疗 。 目前制备 Ｌ一酪氨 酸 的方 法有 三种 ：１ 从 （）
入 ３ ３ 用 活性炭 进行搅 拌 脱 色 ６ ｉ 过 滤 ； ０糖 ０ｍｎ后 滤 液 于 ５ ℃ ， ２ ０～ ． ｏ ・Ｌ 盐 酸溶 液 缓 慢 中 ５ 用 ． ４ ０ｍ ｌ 和至 ｐ ８５～１． Ｈ． ０ ０后搅 拌冷却 至 ４ ℃ 以下 过 滤 、 Ｏ 水 洗 ， Ｌ一酪氨 酸 （ 。滤 液调 ｐ ６０回收利用 。 得 Ⅱ） Ｈ．
左旋多巴
利用重组大肠杆菌生物合成左旋多巴摘要：左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-l-alanine, L-DOPA)是治疗帕金森氏病的主要药物，在保健美容等领域也具有广阔的应用前景。
随着全球人口老龄化的加剧，左旋多巴的需求量也将逐渐提高。
与从植物中提取或化学法合成相比，微生物酶法生物合成左旋多巴具有工艺简单、产量稳定等优点。
酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase, TPL)是生物合成左旋多巴的重要酶。
该酶可以催化邻苯二酚、丙酮酸钠和氨合成左旋多巴。
关键词：左旋多巴、生物合成、基因重组1.1帕金森氏病与L-DOPA左旋多巴又称L-多巴，为酪氨酸的羟化物，在体内是左旋酪氨酸合成儿茶酚胺的中间产物。
左旋多巴一直是帕金森病治疗的金标淮。
在帕金森症状的治疗中,左旋多巴比其他所有药物都更有效,这可能是由干其产物（多巴胺）是一种能同时作用于纹状体内两种多巴胺受体的生理性神经递质,而许多激动剂仅仅激活D2受体。
引起异动和症状波动虽与应用左旋多巴有关,但其根本原因是黑质的严重破坏。
未来左旋多巴新给药方法的思路包括应用药物的新剂型,如经皮钻贴剂、鼻腔喷雾剂、咀嚼片以及缓释剂等[1]。
L-DOPA的衍生物——多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。
Birkmayer 于1961年用左旋多巴治疗PD获得明显疗效[2]。
L-DOPA及复方左旋多巴（如美多芭）已成为治疗常见老年病——帕金森氏病的主要药物[3,4]。
1.2 L-DOPA生产的国内外研究进展1911 年，Casimir Funk 在实验室中第一次成功合成D,L-DOPA。
1913，MarcusGuggenheim 从蚕豆的豆荚中第一次分离提取到天然存在于植物体内的L-DOPA[2]。
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酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化马文静;周景文;徐国强【摘要】以欧文氏菌(Erwinia herbicola)来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大肠埃希菌Escherichia coli BL21为研究对象,研究固定化大肠埃希菌生产L-酪氨酸的条件.以海藻酸钠为载体,采用单因素实验分别考察了载体材料、明胶浓度、反应时间、苯酚浓度和辅助剂(二氧化硅、硅藻土和碳酸钙)等因素对L-酪氨酸生产的影响,发现明胶浓度、反应时间、苯酚和碳酸钙等因素的影响较为显著,进而通过正交实验探索最优条件.结果表明,生产L-酪氨酸的最优条件:载体为4％海藻酸钠与6％明胶的混合载体,苯酚浓度0.08 mol/L,反应时间8 h,于载体中添加0.8％碳酸钙.此条件下,连续反应9次后L-酪氨酸的产量达到64.5 g/L,比优化前提高了451.3％.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2019(039)001【总页数】6页(P26-31)【关键词】L-酪氨酸;酪氨酸酚裂解酶;固定化技术;海藻酸钠【作者】马文静;周景文;徐国强【作者单位】江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122;江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡 214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡 214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122【正文语种】中文【中图分类】Q93-3L-酪氨酸是20种氨基酸中的一种，对人和动物的生长发育及新陈代谢起着重要作用，常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸及以多巴、对羟基苯乙烯等医学化工产品的制备原料，广泛应用于食品、医药和日化等领域[1-2]。
酪氨酸也是构成甲状腺素的重要成分，酪氨酸与神经元的传递有重要关系[3]。
它常被用来治疗忧郁症，甲状腺机能降低，也有助于细胞长久保持年轻化，提高身体免疫力。
随着基因工程技术和酶工程技术的发展，生物合成L-酪氨酸将具有更加广阔的应用前景。
固定化细胞是将具有生理功能的微生物细胞包裹在水不容的载体里，使其可循环利用，不断反应发酵的一种技术，广泛应用于食品、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域[4-5]。
1989年，赵景联[6]通过固定化大肠埃希菌来生产γ-氨基丁酸，可以使95%的谷氨酸被转化成γ-氨基丁酸，也有人以聚乙烯醇作为固定化载体生产α淀粉酶[7]，还有通过固定化来生产乳酸[8]，用2%的海藻酸钠固定乳杆菌，可以让固定化球保持150 h的完整性，没有破碎，使L-乳酸的产量达到45 g/L。
本研究采用固定化细胞的方式，用全细胞酶法技术，充分利用酶活以获得高产量的L-酪氨酸。
常用的固定化方法主要有吸附法、共价法、交联法和包埋法等[9-10]。
L-酪氨酸的制备方法有3种：一种是从含有蛋白质的物质(酪蛋白和玉米等)水解液中提取获得；一种是以葡萄糖为原料，以短杆菌突变育种发酵生产获得；最后一种是以苯酚、丙酮酸和氨为底物利用酪氨酸酚裂解酶进行酶法催化生产。
而最早对于酶法合成L-酪氨酸由Yamada和Kumagai进行了研究[11]。
酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，TPL)，也称β-酪氨酸酶，是依赖于磷酸吡哆醛(PLP)的多功能酶，该酶能够催化一系列的反应。
TPL在生物体外可将丙酮酸、氨和苯酚转化产生L-酪氨酸，在生物体内可将L-酪氨酸催化生成氨、丙酮酸和苯酚。
该酶主要分布于肠细菌内，也存在于一些嗜热菌和节肢动物体中，其中酶活较高的微生物主要是弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)以及嗜热菌(Symbiobacterium thermophilum)等[12-13]。
关于酶法合成L-酪氨酸的研究已有较多报道[14-15]，另外，常俊俊等[16-17]利用TPL全细胞催化丙酮酸或者L-丝氨酸合成酪氨酸，以0.1 mol/L丙酮酸和0.1 mol/L苯酚为底物，反应24 h后，酪氨酸产量为16.17 g/L，转化率达78.6%。
本研究考虑到固定化细胞具有可循环利用、易于制备和分离等优势，将固定化细胞技术与酶法生产L-酪氨酸的过程结合在一起，减少了酶的活力损失，同时大大降低了成本，从而合成更多的L-酪氨酸。
分别用海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇及两者混合物为载体，通过优化载体浓度及发酵过程的条件，以期获得L-酪氨酸的高效生产。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种以欧文氏菌(Escherichia herbicola)为来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大肠埃希菌E. coli BL21。
1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0；TB培养基：胰蛋白胨 12 g/L，酵母提取物 24 g/L，甘油 5 g/L，KH2PO4 2.31 g/L，K2HPO4 12.54 g/L，pH 7.0；固体培养基在此基础上添加2%琼脂粉。
1.1.3 仪器与设备酵母抽提物和蛋白胨，Oxoid公司；其余化学试剂，国药集团化学试剂有限公司。
FE20K pH计，瑞士Mettler-Toledo公司；Eppendorf 5424高速离心机，美国Eppendorf公司。
1.2 方法1.2.1 菌种培养从平板上挑取单菌落在LB种子培养基(kanamycin抗性)中培养10 h，将活化好的种子液以1%(体积比)接种量接入含25 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，培养基中含终质量浓度50 mg/L的氨苄霉素，37 ℃摇床培养2 h，加入终浓度0.2 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)，20 ℃诱导16 h。
培养结束后于7 000 r/min离心收集菌体细胞。
1.2.2 固定化技术将收集的菌体用生理盐水配成质量分数为10%的菌体悬液，与无菌海藻酸钠溶液按体积比为1∶1的比例混合均匀，制备好的菌悬液用电子蠕动泵滴落到配制好的无菌CaC12溶液中形成凝珠，将制好的固定化细胞4 ℃静置2 h后，过滤收集固定化细胞备用。
1.2.3 固定化细胞培养将以1 g湿菌体制作的凝胶球加入20 mL的反应体系：氯化铵 0.65 mol/L，苯酚 0.1 mol/L，丙酮酸钠 0.1 mol/L，磷酸吡哆醛0.15μmol/L，曲拉通(Triton X-100)质量分数为0.1%，氨水调节反应体系pH为8.0，20 ℃、220 r/min培养箱中培养10 h。
反应结束后加入10 mol/L氢氧化钠溶解L-酪氨酸，用高效液相色谱检测L-酪氨酸含量。
1.2.4 色谱条件色谱柱：WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：V(0.1 mmol/L醋酸钠溶液，醋酸调节pH=4.0)∶V(100%甲醇)= 9∶1；紫外检测波长：280 nm；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。
1.2.5 正交试验在单因素实验的基础上，载体浓度、反应时间、苯酚浓度和碳酸钙4个因素对固定化细胞生产L-酪氨酸的影响较为显著，因此采用这4个因素进行L9(34)正交试验，因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment水平因素载体浓度/%反应时间/h苯酚浓度/(mol·L-1)碳酸钙/%1480.060.426100.080.638120.10.8注：%表示质量分数2 结果与分析2.1 固定化细胞载体的选择用来做固定化细胞的载体有很多，考虑到价格、成本、危险性以及操作的难易程度，选择海藻酸钠、明胶和聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)等作为固定化细胞的载体，以戊二醛[18-20]为交联剂，采用包埋和交联结合的方法进行固定化。
分别制作以海藻酸钠、海藻酸钠-明胶和海藻酸钠-PVA为载体，以戊二醛为交联剂的固定化细胞，反应结果如图1。
从图1可以看出，载体中添加戊二醛固定化对TPL的影响较大，几乎没有目的产物L-酪氨酸的积累，而不添加戊二醛的载体中，混合载体海藻酸钠-明胶的效果比单一载体海藻酸钠好，总产量能够达到15.4 g/L。
2.2 固定化细胞载体浓度的选择制作以海藻酸钠和不同浓度明胶的混合载体为载体，分别取质量分数为6%、8%、10%、12%、14%的明胶与4%的海藻酸钠作为混合载体，结果如图2所示。
随着明胶浓度的增加，L-酪氨酸的产量开始提高，但明胶浓度继续增加时，L-酪氨酸的产量开始下降然后再上升，但上升的幅度不大，当6%浓度明胶与4%海藻酸钠为混合载体时，L-酪氨酸的产量达到最高为17.1 g/L，比4%海藻酸钠高13.3%。
图1 不同载体对固定化生产L-酪氨酸的影响Fig.1 The influence of different carrier on the immobilized production of L-tyrosine1:4%海藻酸钠+4%氯化钙；2:4%海藻酸钠+6%明胶+4%氯化钙；3:4%海藻酸钠+4%氯化钙+10%PVA+硼酸；4：4%海藻酸钠+10%PVA+4%氯化钙；5：4%海藻酸钠+4%氯化钙+10%明胶；%表示质量分数；2和4表示两种载体先混合再与菌体混合滴入氯化钙中，3和5表示单独海藻酸钠与菌体混合再滴入氯化钙成球后用明胶或PVA包裹成型1:4% sodium alginate + 4% calcium chloride； 2: 4% sodium alginate + 6% gelatin + 4% calcium chloride； 3: 4% sodium alginate + 4% calciumchloride + 10% PVA + boric acid； 4: 4% sodium alginate + 10% PVA + 4% calcium chloride； 5: 4% sodium alginate + 4% calcium chloride + 10% gelatin. % represents the quality score; 2 and 4 indicate that the two carriers were first mixed with bacteria and then dribbled into calcium chloride; 3 and 5 indicate that sodium alginate alone was mixed with bacteria and then dribbled into calcium chloride and formed into a ball, which was then coated with gelatin or PVA图2 载体浓度对固定化生产L-酪氨酸的影响Fig.2 The influence of carrier concentration on the immobilized production of L-tyrosine2.3 反应时间对发酵生产L-酪氨酸的影响分别制作以质量分数为4%海藻酸钠、4%海藻酸钠与6%明胶为混合载体的固定化细胞，取不同反应时间5、10、12 h，考察反应时间对固定化细胞生产L-酪氨酸的影响。