目的基因的克隆与基因文库的构建
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
4目的基因的克隆2
得较好的效果。பைடு நூலகம்
（2）引物
a．引物设计的一般原则：
PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16bp以上，一般以20—30个bp 为宜。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列。 引物中GC含量应占到45％一55％左右。 应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3'端不应有互 补结构。 引物3'端应与目的片段完全配匹，而其5'端碱基可不与模板完全 配匹，故可在引物5，端引入限制酶切位点。
L Tris-HCl(pH8.3室温下)，1.5 mmol／L MgCl2。
缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，其中Mg2+优于Mn2+，而Ca2+ 则无效，Mg2+的浓度对反应的特异性和PCR产率影响最大，其最佳 作用浓度1.5mmol／L。因此，所制备的模板DNA中不应含有高浓度 的螯合剂，如EDTA，也不应有高浓度的负电荷离DNA（comp成cDNA，与载 体连接并转化大肠杆菌的过程。 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种 类不同（即基因pp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTTp 5’ Klenow dNTPs
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
四、常用的标准cDNA克隆构建操作：
℃ ，3—10min；循环过程中变性
在适宜退火温度下，退火时间30s已足以使引物与模板之间的结
合。 在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可提高PCR反应的特异
性。
延伸的时间和温度：
PCR反应的延伸一般在70～75℃之间进行，在此温度范围内耐热的 DNA聚合酶处于最高的活力状态；在72℃时，DNA聚合酶的反应速率
基因工程思考题
《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。
2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。
4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。
8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。
目的基因的克隆与基因文库的构建
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，
分离纯化困难
仅限于克隆蛋白质编e Chain Reaction）法，又称为聚合酶
链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的
基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必
需的双引物
PCR法定向扩增目的基因的基本原理
C PCR法
5‘
5‘
目的基因
5‘
变性
加热
5‘
5‘
引物
退火
5‘
5‘
底物
聚合
5‘
5‘
5‘
5‘
加热
变性
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
5‘
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
化学合成法的基本战略
全基因合成
1
混合退火
2
T4-DNA连接酶连接
3
克隆入合适的载体
4
Klenow酶聚合
5
大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段
6
化学合成法的基本战略
全基因合成
上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%
基因工程中为什么要建立基因文库
基因工程中为什么要建立基因文库？基因文库是如何建立的？基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。
目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。
构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。
打个比方让你建图书馆，你就得把所有书分门别类放，以便于找。
这么多书你一个人又搞不定，所以你得找一群人，一个人负责一部分，各自干各自的，然后最后一汇总就行了。
基因组文库和cDNA文库一.基因组文库用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。
这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。
二.cNDA 文库的构建及应用cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。
与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA 为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。
cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。
随着分子克隆研究在理论和技术上的进步，cDNA 基因文库的构建不仅是分离基因的重要手段，也是当前真核分子生物学研究的强有力工具。
首先，在基因工程的操作中，以cDNA为探针可从基因组文库中分离出相应的特异基因；其次，cDNA序列只与基因中的编码序列有关，有助于对真核生物mRNA结构和功能的认识；再者，cDNA 克隆还可以有效地分析真核基因的结构和功能。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
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AAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’ 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
3’ Klenow dNTPs 5’ TTTTTTTTTTTTTTp AAAAAAAAAAAAAA 5’ S1
OH 3’
TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA
cDNA第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 ’ G 5‘pppG
助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛 选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序
特异分离程序
提 取 细 胞 总 mRNA， 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 ， 回 收 目 标
目的基因
5 ‘ 5 5
5 ‘ 5 ‘ 5
5
‘ 5
变性
加热
‘
聚合
底物
‘ 5 ‘ 5
‘
5 ‘
5
退火
引物
5 ‘
‘ 5
3 1
‘ 5
‘ 5 ‘ 5 ‘
退火
引物
‘ 5
5
‘
聚合
底物
5 ‘
‘
‘
5
5 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘
重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进
2. 在连接前将DNA片段进行分级分离
例如，已知某目的基因位于1.8 kb的 SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开
，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相
当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块， 从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载 体进行拼接
5’
cDNA第二链的合成 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
’ G 5‘pppG 3‘ 5
HO ’ G 5‘pppG
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCT P NaO H TTTTTp 5’ AAAAACCCCCCCOH TTTTT p 5’ 3’
3‘ 3‘
5
HOCCCCCCC
HOCCCCCCC
退火
TTTTTp 5’ Kleno dNTP
3‘ 5‘ HOCCCCCCC 3p ‘ GGGGGGG 5‘ HOCCCCCCC
w
s
TTTTTp 5’ AAAAAOH
cDNA法分离目的基因的基本程序
完备分离程序
提取细胞总mRNA，合成总c 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合
成目的基因，然后将之克隆表达。
一 鸟枪法 二 cDNA法 三 略
随机克隆供体细胞的全 基因组DNA片段，然后通 过快速有效的筛选程序从众 多克隆中分离出含有目的基 因的目的重组子，进而获得 目的基因。鸟枪法适用于原 核细菌目的基因的克隆分离 。
2.0 kb 1.8 kb
1.6 kb
一 鸟枪法 二 cDNA法 三 本策略
cDNA第一链的合成
mRN
’ G 5‘pppG 5 ’ G 5‘pppG 5 ’ G 5‘pppG 5 A AAAAAAAAAAAAAA
OH 3’
引物
退火
或确定其表达调控机制和生物学功能
分离克隆目的基因 ( 前 提 )
或建立高效表达系统，构建目的基因在体外进行必要的结构 功能修饰，然后输回细胞内改良生物 体的遗传性状，包括人体基因治疗
基因的克隆战略
• 一类是构建感兴趣的生物个体的基因，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基
鸟枪法克隆目的基因的基本策略
1.染色体DNA的片段化
超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的 基因断开，大小不可控 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整
2.与载体连接 3.转化受体细胞 4.筛选含有目的基因的目的重组子
菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
AAAAAAAAAAAAAA
逆转录酶
dNTP s
TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’
5’
AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’
cDNA第一
链
5’
cDNA第二链的合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
’ G 5‘pppG 5 NaOH
mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆
特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如 血红蛋白基因等
cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构
细菌或原核生物的mRNA半衰期很短
mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯 化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
一 鸟枪法 二 cDNA法 三 基本原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称 为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的 体外DNA聚合程序 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩 增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学 合成聚合反应必需的双引物
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识
不能获得最小长度的目的基因
不能除去真核生物目的基因的内含子结构
鸟枪法操作的改进
1. 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高
5 RNaseH AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT p OH 3’ DNApol dNTPs 5’ AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ S1 5’ 3’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH AAAAAAAAAAAAAA 3’ T4-DNA ligase p 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’