目的基因的克隆与分离鉴定(2)
第讲 目的基因的克隆与分离
第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。
目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。
本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。
一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。
PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。
PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。
2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。
基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。
其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。
基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。
3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。
这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。
限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。
二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。
它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。
分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。
2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。
这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。
化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。
3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。
通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。
生物技术制药课后思考题
第一章：绪论思考题1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。
答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。
（具体定义见P1）。
2.生物技术药物的概念及分类。
答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。
2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。
3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。
答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短；e.有种属特异性；f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。
4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。
答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。
2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。
第二章：基因工程制药思考题1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。
答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
高中生物4章基因工程2节基因工程的操作程序2课时目的基因的导入和检测
第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。
2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。
[重难点击] 1.目的基因的导入方法。
2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。
在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。
方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的第四步工作。
以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。
因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。
检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、目的基因的导入1．花粉管通道法(如图)(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。
常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。
(2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。
②操作过程a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。
b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。
c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
实验动物遗传育种学复习题
实验动物遗传育种学1. 实验用动物（Experimental Animal）: 又称广义实验动物。
泛指用于科学实验的各种动物，包括经过人们长期家养驯化，按科学要求定向培育的动物。
2.实验动物（Laboratory Animal）: 又称狭义实验动物。
指经人工培育和人工改造，对其携带的微生物和遗传、营养、环境实行控制，来源清楚，遗传背景明确，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。
3. 无菌动物（Germ Free Animals）：动物机体内外不带有任何用现有方法可检测出微生物或寄生虫的动物。
4. 无特定病原体动物（Specific Pathogen-Free Animal, SPF）：机体内无特定的微生物和寄生虫存在的动物，或在清洁动物的基础上，不带对实验有干扰的微生物。
5. 清洁动物（Clean Animals,CA）：无人畜共患病和主要传染性疾病的病原体和体外寄生虫的动物。
6. 普通动物（Conventional Animals,CV）：无人畜共患病病原体和体外寄生虫的动物7. 种(species)：是生物学分类的最基本单位。
在实验动物学中，种是指有繁殖后代能力的同一种类的动物。
8.品种(stock) :育种学上的概念。
有相同或相似的生物学特性构成的群体叫品种。
9. 品系(strain) ：在实验动物学中把基因高度纯合的动物称作品系动物。
10. 近交系的定义：近交系实验动物在兄妹交配20代以上,又可以追溯到一对共同亲代的，有时也可以亲子交配,并需与年轻一方的亲代交配，而形成的品系，一般称之为近交系。
目前，主要是在大鼠和小鼠中育成近交系的品系。
11. 基因纯合性：在一个近交系内的所有动物的基因位点都应当是纯合子，在本品系内任何个体交配的后代也应当是纯合子，即基因型一致，遗传特性相同。
从理论上说，这些动物是不应有暗藏的隐性基因的，用近交系动物做实验时，不会因为隐性基因的暴露而影响实验结果的一致性。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
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3.转化受体细胞
➢ 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能 使目的基因表达的受体细胞；
➢ 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。
4.筛选含有目的基因的目的重组子
➢ 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的 建立）
30ul溶液III至管内柱面上，放置1分钟； 10.高速离心1分钟，所得液体即为高纯度DNA。
(三)鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
二、cDNA法
cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法克隆目的基因的局限性
该基因的功能或序列并不一定要了解。
3、基因分离
从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的基 因或DNA片段。
❖基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因。
➢确定其表达调控机制和生物学功能； ➢建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞）； ➢将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰； ➢然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人 体基因治疗。
一、 鸟枪法
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性
(一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略
鸟枪法（shot-gun approach)：随机克隆供体细胞 的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程 序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子， 进而获得目的基因。
鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。
1.染色体DNA的切断
➢超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端； ➢全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有 可能使目的基因断开，大小不可控；
➢部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整。
2.与载体连接
➢ 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择多拷贝克隆载体；
(二) 鸟枪法操作的改进
使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA
使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切 图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理 染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基 因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频 率。
在连接前将DNA片段进行分级分离
❖一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合 成目的基因，然后将之克隆表达。
第一节 目的基因的克隆
A 鸟枪法 B cDNA法 C PCR法 D 化学合成法 E 基因的构建❖凝胶DNA片段回收程序
1.切胶回收于离心管中； 2.加入等体积的溶液I； 3.50-60℃水浴加热约10分钟至胶融解； 4.加入到DNA纯化柱内，室温放置1分钟； 5.离心1分钟，倒弃收集管内的液体； 6.加入700微升溶液II，室温放置1分钟； 7.离心1分钟，洗去杂质； 8.加入500微升溶液II，最高速离心1分钟； 9.将DNA纯化柱置于1.5ml离心管上，加入
(二) cDNA法克隆目的基因的局限性
并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因
三 PCR法
(一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理
生物技术专业核心课程
基因工程
6 目的基因的克隆与分离鉴定
目的基因的克隆 目的基因的分离鉴定
❖基因克隆与基因分离
个体水平上的克隆 1、克隆 细胞水平上的克隆
分子水平上的克隆
2、基因克隆
分子水平上的克隆，将某一段DNA或一个基因插入到 一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄 主/载体单元，称为一个克隆。
例如，已知某目的基因位于1.8 kb 的SalI片段中，将染色体DNA用SalI 切开，琼脂糖凝胶电泳分离；
用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小 区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收 DN kb
1.8 kb
❖凝胶DNA片段回收技术
冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法
问题
鸟枪法获得的克隆群体庞大
以人的基因组为例，如果载体承受外源DNA片段 的能力为1-3kb；那么,人类基因组DNA需被切割成 几十万个大小不等的片段；
每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就 会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体；
要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因 的克隆，显然是非常费事的。
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G 3‘HO
G 5‘ppp’5 G 3‘ HOCCCCCCC
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG
TdT NaOH Klenow
dCTP 退火 dNTPs
AAAAAOH3’ TTTTTp5’
(一) cDNA法克隆目的基因的基本战略
1.cDNA第一链的合成
G 5‘ppp’5 G
mRNA
引物 退火
G 5‘ppp’5 G
逆转录酶
dNTPs
G 5‘ppp’5 G
cDNA第一链
AAAAAAAAAAAAAAOH3’
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’
AAAAAAAAAAAAAAOH3’ TTTTTTTTTTTTTTp5’
AAAAACCCCCCCOH3’ TTTTTp5’
TTTTTp5’
TTTTTp5’ AAAAAOH3’
3.双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA与载体的连接： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾， 这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理 回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收