肌动蛋白的克隆与鉴定

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阴茎海绵体平滑肌细胞的鉴定分析进展

阴茎海绵体平滑肌细胞的鉴定分析进展作者：陈世涛吕伯东黄晓军论文关键词：阴茎海绵体平滑肌细胞鉴定论文摘要：阐述体外培养阴茎海绵体平滑肌细胞(corpuscavernosumsmoothmusclecell，CMSC)的鉴定方法。

比较不同方法对于体外培养的阴茎海绵体平滑肌细胞(CMSC)的鉴定分析及其特异性，优化研究勃起功能障碍所需要的CMSC培养模型。

勃起功能障碍是一种多因素引起的男科难治性疾病[1]，严重影响患者的整体健康和生活质量[2]。

阴茎海绵体平滑肌细胞(CSMC)是组成阴茎海绵体的主要功能成分，约占整个阴茎组织成分40％～50％，是调节阴茎勃起及维持勃起的重要因素，是阴茎神经调控的主要效应器部位[3-4]，因此关于阴茎海绵体平滑肌细胞的研究显得尤为重要，而CSMC的培养和鉴定是研究的基础，因此CSMC纯化鉴定在细胞水平上研究ED的机制颇为关注，就体外培养的CMSC鉴定分析做一综述。

1988年,Krall等[5]首先运用体外培养的人CMSC研究了勃起相关的生化反应。

此后，体外培养扩增CMSC成为ED 基础研究的重要手段[6]，但尚缺乏对体外培养的CMSC的特异性鉴定方法。

Granchi等[7]很早就发现成人海绵体平滑肌细胞的培养过程中很难避免成纤维细胞污染。

目前被奉为经典的Pilatz等[8]文献报道中海绵体平滑肌细胞的培养纯度也仅达到25%左右。

现在鉴定CMSC 的方法一般有光镜、透射电镜观察、相差显微镜观察、免疫组化印记法、免疫细胞化学法等[9]。

1CMSC的形态鉴定在常规染色中，第2代传代培养的CMSC常规苏木精、伊红染色，显微镜下观察。

苏木精伊红染色显微镜显示培养细胞胞质被染成红色，且清晰、均匀，胞核染成蓝色。

另外还有一些特殊的染色方法，参照杜卓民[10]方法，标本获取、固定同常规染色法，显微镜下观察。

Masson三色染色法显示培养细胞胞质被染成红色。

VG染色显示培养细胞胞质被染成黄色，传代培养的细胞Masson三色染色法及VG染色细胞纯度在98％以上[9]。

西方蜜蜂肌动蛋白基因启动子的克隆与序列分析

功克隆了该启动子。关键词：西方蜜蜂；肌动蛋白基因；启动子：克隆分析中图分类号：８Ｑ７２文献标识码：Ａ文章编号：００— ３４２０）２— ２５— ４１０２２（０８００５０
ＣＬｏＮＧＡＮＤＥＳＱＵＥＣＥＡＮＡＬＹＳＳｏＦＡＰ，ＩＳＭＥＺＲＡＡＣＴＩＧＥＮＥ．Ｚ，ＡＮＰＲｏＭＯＴＥＲ
维普资讯
山东农业大学学报（自然科学版）０８９（）５２８，２０，３２：２５— ５
ＪｕｎｌｆｈｎｏｇＡｒｕｔｒｎｖｒｉ（ａｒｃｅｃ）ｏｒａｏａｄｎｇｃｌａＵｉｅｓｙＮｔａＳｉｎｅＳｉｕｌｔｕｌ
ｉｎｅｏｒｅｆｉｎｏｍｔｎｈｏｏｅｉｓｑｅｃｓｆｐｓｕｅａＡｔｅｅｗｒｒｑｅｔｉｃａｄｒｓｕｃｓｏｆａｉ．ｔｅｃｄｇｎｃｅｕｎｅ／ＭｅｉｒｃｉｇｎｅｅｅｕｓｄｗｔｓｏｂｉｒｏｏＡｆｎｅｈＮＢａｂｓ．ａｄｔｅｓｑｅｃｓｏｐｓｆｅｃｎｇｎｒｍＡ／ｍｌｅｉｇｓｃｐｎｌｇｎｍＣＩｔａｅｎｈｅｕｎｅｆ／ｄａＡｆｒＡｔｅｅｆｐｓｅｉｒｌｕｔａＳｉｏａｅｏｅｉａｆｉｏｌａｎｉｆＤＡｗｒａａｚｄａｄｃｎｄａｅｌｓｎｉｐｍＵｅａｌｇｓｃｐｎｌｇｎｍｅｈｃｎｇｎ — ＮｅｅｎｌｅｎｌｅｆｒａｔｇｗｔＡｅｉｒｉｕｔａＳｉｏｅｏ．ＴｅＡｔｅｅｉｙｏｔｂｉｈｆｎｉａｉｎｃｕｅｔｒｅｄｎＡＧ、ｏｏｏＡｏｅａｉｇｒｍｅＯＰ）ＴＴｏ（一２ｐ、ＡＴｂｘ６ｂ）ｌｄｓｒｔｏｏＴｓｐｅｄｎＴＡ、ｐｎｒｄｎａ（Ｒ、ＡＡｂｘ３ｂ）ＣＡｏ（一９ｐｓａｔｅｆａｄｐｏＡ（＋１９ｂ）Ｔｅｇｎｈｃａｏｍｌｈｒｃｅｆｅｅｆｕａｙｔｉａｍｌｅｎ．ｒｅｐｏｎｌｙ３６ｐ．ｈｅｅｉｈｓｒａｃａａｔｓｏｎｋｒｏｓｎｃｐｅｅ，ｒ一ｗｈｎｒｇｏｅｅｏｔｏｈ

巴西橡胶树肌动蛋白的原核表达及鉴定

热带作物学报２０１３。３４（５）：７９５ — ７９９
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｏｉｃａｌＣｒｏ
巴西橡胶树肌动蛋白的原核表达及鉴定
邓顺楠．一，史敏晶，吴绍华，树；肌动蛋白细胞骨架；乳管堵塞：原核表达
中图分类号￥７９４．１文献标识码Ａ
ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｉｃｆａｔｉｏｎｏｆＡｃｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎｉｎＬａｔｉｃｉｆｅｒＣｅｌｌｓｏｆＲｕｂｂｅｒＴｒｅｅ
ＡｂｓｔｒａｃｔＡＣＴＩＮ，ａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆｔｈｅｐｌｕｇｓａｔｔｈｅｅｎｄｏｆｔｈｅｓｅｖｅｒｅｄｌａｔｉｃｉｆｅｒｓ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＡＣＴＩＮｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｈｅｐｌｕｇｓ，ｔｈｅＡＣＴＩＮｇｅｎｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｂｕｎｄａｎｃｅｉｎｔｈｅＥ．ｃｏｉｌ

国兰肌动蛋白基因片段的克隆与表达分析

ｃｄｇｓｑｅｃｓｅｃｄｇａｐｏｅｆ６ｍｉｃｓＴｅｒａｅｓＣＡＴｎｇＣ１（ｎａｋｏｉｅｕｎｅ，ｎｏｉｒｔｏ２ａｎａｉ．ｈｙｗｅｅｎｄａｓＣ１ａｄＣＡＴＧｅＢｎｎｎｎｉ３ｏｄｍ
ＣｌｎｎｇａｄＥｘｒｓｉｎＡｎｌｓｓｏｆａｍｅｔｒｍｙｏｉｎｐｅｓｏａｙｉｆＡｃｎＦｒｇｎｓｆｏＣｍｂｄｕｉｉｉｍ
ＴＩＡＮｉｕ，Ｒｕ — ｅｘＺＨＡＮＧｈｅ — ｎｇ，ＺＨＡＮＧｉｎｘａ，ＳｎｇｐｅＪａ — ｉ
Ａｂｓｒｃｔａｔ：Ｃｒｓ — ｔｏｒｅｓｗｅｅｄｓｇｄａｃｒｉｇｔｈｕｅｔｅｓｑｅｅｏｈｉｆＰｈｌｅｏｉ，ｏｓｉｒｎｐｉｒｒｅｉｎｅｃｏｄｎｏｔｅｎｃｌｏｉｅｕｎｃｆｔｅＡｃｔｏａａｎｐｓｓｎｍｄｎａｔｏｎｄＡｃｉｈｍｏｌｇｙｆａｍｅｔｒｍｙｍｂｄｉｍｉｅｓｎｇｏｒｇｉｗｅｅｏｔｉｅｙｒｖｒｅｔａｓｒｐｉｎｎｏｇｎｓｆｏＣｒｉｕｓｎｎｅａｄＣｅｉｉｒｂａｎｄｂｅｅｓｒｎｃｉｔｎｏ
ＴｈｅｕｌｈｗｅｈｔｔｅＡｃｉｒｍｅｔｏＣ￣ｅｌｅａｄＣｅｍｇｉｗｅｅ１３ｐｉｅｇｈｅｒｓｔｓｏｄｔａｈｔｆａｓｎｎｎｓｆｍｓｎｒｇｏｒｉｒ３５ｂｎｌｎｔｗ１８ｐｒｓｎ０６ｂ

实验二鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定

实验二鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定一、实验内容1．利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白。

2．采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量。

3.对以上蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。

4.将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行Western blotting鉴定。

二、实验目的和要求1．了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法。

2．熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。

3．掌握SDS-PAGE的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。

4．掌握Western blotting操作方法。

三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液枪及枪头、微量离心管（又称Eppendorf 管）、50ml离心管、常用玻璃器皿（见表1）、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系统。

（二）试剂准备1．Buffer I（2000ml）：20mM Tris-Cl, pH8.0 。

2．Buffer II（500ml）：Buffer I含有0.5M NaCl。

四、实验操作（一）动物肌肉蛋白的提取1．称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉，用刀切碎，称取3g左右，加入30 ml 左右冰冷的Bufffer I（鱼肉[g]：BuffferI[ml]=1:10），在捣碎机中捣碎成匀浆。

2．将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，10000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。

3．上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）4．在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Bufffer I，重悬沉淀，在4℃下，10000×g，离心15min，取沉淀。

新生Wistar大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定

细胞特异性蛋白（ＴＴ抗体和仪肌动蛋白（ａｔ）克隆抗体分别对培养的心肌细胞进行免疫荧光及免疫ｃｎ） —ｃｎ单ｉ组织化学鉴定，结果均呈阳性。关键词大鼠，新生心肌细胞分离培养
随着心血管疾病在基础医学及临床医学研究
１０ｒｍｎ心１ｍｉ；上清，胞沉淀用含０／ｉ离００ｎ去细２％ＦＳ的ＤＭ／１培养液悬浮、散，０ＢＭＥＦ２吹
１０ｒｍｉ离心１ｍｎ０／ｎ００ｉ。细胞沉淀用含２％ＦＳ０Ｂ的ＤＭＦ２培养液悬浮、ＭＥ／１吹散，细胞计数，调整密度至１ｍ。将细胞接种于预先涂布有１个／ｌＸ０Ｉ鼠尾胶原蛋白的１细胞培养板内，型２孔同时每
沈部阳队
霄
・
２５・４
新生Ｗｉａ大鼠心肌细胞的分离培养与鉴定ｓｒｔ
陈克研王洋
摘要
王承利
张
贺梁
娟孙
倩苏
朋
本实验取新生２ｈ内的Ｗｉａ大鼠心肌组织，４ｓｒｔ无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞，用含２％胎０
培养组织来源的种属，离培养其原代心肌细胞，分
为预防及治疗心血管疾病药物的研发等提供良好
的实验体系。１材料与方法
１１材料．
孔加１￣ｏ／的阿糖胞苷２，３℃ 、％０ｍｌＬ０ｌ置７５Ｃ：培养箱内培养。２ｈ后用含１％ＦＳ的Ｏ４０Ｂ

地黄肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

ｔａｐｆｔｃｎｇｅｒｍＲｈａｎｌｌｓ．ＲｓｌＴｅｍｌｉａｍｎｉ７ｐｄｃｒｓｏｄｇ０ａｉｉ，ｌＬＳ０ｍｌｙｈａｔｅｏｅｍｎｉｇｔｏ［ｅｕ］ｈｐｆｄｇｅｔｓ２ｂｒｐｎｉｌ２ｎａｄＴ】ＢＡＴｉｅｉｎｆａｕｎａｔａｉｅｆｒ４ｎａｏｅｎｙ４ｍｏｃｓｅ
孙鹏，郭玉海，祁建军，周莉丽，李先恩
（．１中国农业大学农学与生物技术学院，北京１０９２中国医学科学院药用植物研究所，００４；．北京１０９）００４
摘要［目的］隆与分析地黄肌动蛋白基因片段。［法］克方根据与地黄相近物种肌动蛋白基因序列的保守区设计兼并引物，通过Ｒ — ＴＰＲ方法扩增地黄编码区肌动蛋白基因。［Ｃ结果］增片段全长为７４ｂ，扩２ｐ对应编码２０个氨基酸。序列比对分析发现其与其他高等植４物肌动蛋白基因核苷酸序列同源性在８％／＿，０Ｘｋ氨基酸序列在９％以上。［０结论］系统进化分析表明，扩增到的地黄肌动蛋白基因与烟
肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在最保守的古老蛋
白质之一。在研究植物基因时，动蛋白基因常被用作内参肌基因来衡量其他基因的表达情况。该基因在核苷酸序列和氨基酸序列上非常保守，就被子植物而言，同义核苷酸替换
ｒｓｌｓｉｄｃｔｈｔｔｅｈｍｏｏｙｂｔｅｈｍｐｉｅａｍｅｔａｄｏｈｒｈｇｅｌｎｓｆｒａｔｅｅｓｑｅｃｓａｄａｎｃｄａｅｍｏｅｔａｅｕｔｎｉａｅｔａｈｏｌｇｅｗｅｎｔｅａｌｄｆｇｎｎｔｅｉｈｒｐａｔｂｃｉｇｎｅｕｎｅｍｉｏａｉｒｒｈｎｉｆｒｎｎ

P57蛋白与HeLa细胞膜结合区的鉴定

P57蛋白与HeLa细胞膜结合区的鉴定张祥;金萌萌;黄鹏;张世谦;张里程;唐佩福【摘要】目的研究肌动蛋白结合蛋白P57的性质、功能及其与细胞膜结合位点.方法用荧光显微镜观察野生P57蛋白及几种P57缺失突变体蛋白在细胞内的分布.利用细胞吹裂技术检测野生型P57及它的几种缺失突变体蛋白与细胞膜的结合.用差速离心技术分离亚细胞组分,用Western blot检测各组分中蛋白的含量.结果P57蛋白的386-461片段具有与全长蛋白相类似的细胞分布及细胞膜结合能力,而1-299和1-432片段均不具有此能力.另外过量表达的386-461片段还可以竞争全长蛋白的膜结合位点.结论 P57是由其C末端区域(于386-461片段)负责蛋白与细胞膜的结合.%Objective To study the property and function of P57 protein, and to identify the plasma membrane binding sites with HeLa cell. Methods The distribution of wild-type P57 and its mutants in cells were observed by fluorescence microscopy. The blowing crack technology was used to detect the binding between the wild-type P57 and its mutants with plasma membrane. Differential centrifugation technology was used to prepare subcellular components and the contents of P57 in subcellular components were detected by Western blot. Results It was found that the fragment 386 -461 of P57 has a similar distribution in cells and similar plasma membrane binding abilility as the intact protein, but the fragment 1 -299 or 1-432 hasn't. Overexpression of the fragment 386 -461 can compete with P57 for membrane binding. Conclusion The C-terminal domain containing the fragment 386 -461 is responsible for the binding of P57 to plasma membrane.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2011(031)003【总页数】6页(P231-236)【关键词】P57;细胞膜结合区域【作者】张祥;金萌萌;黄鹏;张世谦;张里程;唐佩福【作者单位】西安医学院附属第一医院骨外一科,陕西,西安,710077;北京大学医学院第一临床医院,内分泌科,北京,100034;中国人民解放军总医院,北京,100853;哈尔滨医科大学附属第一医院,骨外一科,黑龙江,哈尔滨,150001;中国人民解放军总医院,北京,100853;中国人民解放军总医院,北京,100853【正文语种】中文【中图分类】Q73P57,又名 coronin 1a,TACO,是哺乳动物类冠蛋白(coronin)家族成员之一[1]。

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β—肌动蛋白的克隆与验证李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。

Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。

Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。

[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。

具有收缩功能，分布广泛。

β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。

它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

[2]本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。

通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。

关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR1材料与方法1.1 组织细胞DNA提取。

[3]1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。

器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。

1.1.2 方法取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。

在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。

于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

加2倍体积的异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100微升吸头挑出晾干，用200微升TE重新溶解。

加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000rpm 5min。

取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混合后室温沉淀2min,离心12000rpm 10min。

小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

用1ml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm5min。

小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

加200微升TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。

1.2 PCR扩增1.2.1 器材：PCR仪、移液枪、上下引物、去离子水、反应缓冲液，模板DNA、组织DNA1.2.2 方法在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性（高温使双链DNA解离形成单链。

）、退火（低温下，引物与模板DNA互补区结合）、延伸（中温延伸，DNA聚合酶催化引物为起始点的DNA链延伸反应与），体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA在PCR管中依次加入下列溶液：PCR预混液12.5微升、去离子水9.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升、组织DNA1微升。

共计25微升体系设置PCR反应程序： 94℃ 5min94℃ 30s58℃ 30s 32个循环72℃ 1min72℃ 8min1.3电泳1.3.1仪器：水平电泳槽.电泳仪.凝胶成像分析系统.微波炉.微量移液器.透明胶带.点样板.100ml或250ml锥形瓶.量筒.吸头等。

试剂：50x TAE.Tris溶液.冰乙酸.EDTA溶液.去离子水.1xTAE缓冲液.琼脂糖.溴化乙啶贮存液.溴化乙啶.溴酚蓝.二甲苯青.甘油.其他：DNA样品.DNA Ladder。

1.3.2方法称取 1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150ml1xTAE瓶口倒扣小烧杯100℃加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀即成10％琼脂糖凝胶液。

胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净，晾干.放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。

将内槽置于水平位置并在固定位置放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子、取下胶带、将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1xTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x。

用10微升微量移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应该更换一个加样头以防污染，加样时勿碰坏样品周围的凝胶面。

电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100v。

样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，电压升高琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1㎝处时停止电泳。

观察照相：在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

琼脂糖凝胶电泳回收按电泳回收试剂盒操作，回收电泳。

1.4 感受态细胞与T载体的连接1.4.1 设备：移液器、离心机、感受态细胞、T载体1.4.2 方法PUD-187 取0.5-1.0微升回收纯化的DNA 2微升或3-4微升，看具体浓度。

加水补至5微升，再加入5毫升SOLUTION1，冰上助融。

共10微升在16摄氏度放置30分钟，之后4摄氏度过夜。

1.5 细菌转化1.5.1 设备 LB液体培养基LB固体培养基，抗生素，，氨苄青霉素，配成100mg/ml，备用，0.1mol/L.CaCl2aq.接种针移液管，培养皿，净化工作台，摇床，恒温水浴锅，离心机。

X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-D半乳糖)X-gal溶于N，N＇-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。

-20℃避光保存，IPTG（异丙基-β-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20℃，氨苄青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml灭菌水中。

配成母液保存于-20℃1.5.2 方法LB液体培养基：胰蛋白酶1g，酵母粉2克，氯化钠1克，pH7.2-7.4（分装，20毫升/250毫升，三角瓶，3毫升试管0.07兆帕高压灭菌30分钟）。

LB固体培养基：LB液体培养基加入1.6%琼脂粉即可。

（分装50毫升/250毫升，三角瓶，加入8克琼脂粉0.07兆帕高压灭菌30分钟）。

1mol/l氯化钙（称取1.1克无水氯化钙，溶于90毫升蒸馏水，定容100毫升，装在250毫升三角瓶，0.07兆帕高压灭菌30分钟，4摄氏度保存）。

从-70摄氏度冰箱中取出感受态细胞，放入冰水中融化，放置大约10分钟。

用冷却后无菌吸头将连接好的DNA混合液加入到感受态细胞中（每100微升感受态细胞加连接产物5微升）旋转混合内容物，在冰上放置30分钟在将离心管放置于42摄氏度水浴锅热激90秒，切勿摇动试管。

迅速转移到冰浴中，令细胞冷却1-2分钟。

每管加400微升的LB液体培养基，转移到37摄氏度摇床温浴45分钟，转速不超过125转，使得细胞复苏（一般4-5小时菌液才能浑浊），摇完后4000转每分钟离心2-3分钟，弃去上清液200微升，使菌液浓度增加，用枪吹打后，再涂平板。

平板准备在40微升 X-gal（中加入4微升 IPTG充分混合，在无菌条件下涂布于含AMP（浓度50微升每毫升）的LB平板上将平板至于37℃恒温箱中2-3h，意识培养基充分吸收色素底物X-gal。

涂板将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-gal IPTG的平板上正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板。

37℃培养12-18h1.6验证1.6.1PCR扩增实验实验材料：仪器：吸头，PCR仪器，移液枪材料PCR预混液12.5微升，水9.5微升，上游引物1微升，下游引物1微升，组织DNA1微升实验内容及步骤：1配制25微升反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液中模板RNA 1微升上游1微升下游引物1微升，PCR预混液12.5微升，ddH2O0.95微升。

2.设置PCR反应程序[3]强变性 94摄氏度 5分钟变性 94摄氏度 30秒退火 58摄氏度 30秒延伸 72摄氏度 1分钟最后延伸 72摄氏度 8分钟共32 个循环1.上样启动反应程序2.扩增产物的电泳检测（取5毫升）1.6.2电泳实验所用设备：水电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统，微波炉，微量移液器，透明胶带，点样板，锥形瓶，量筒，吸头。

50XTAE,Tris溶液，EDTA 溶液，去离子水，1XTAE缓冲液琼脂糖溴化乙叮贮存液，溴化乙啶，溴酚蓝，甘油，其他,DNA 样品。

实验内容及步骤：1.琼脂糖凝胶电泳的制备：称取1.5克琼脂糖置于锥形瓶中，加入150毫升 1XTAE 瓶口倒扣小烧杯100摄氏度加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成百分之1琼脂糖凝胶液。

2.胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽洗干净晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。

将内槽置于水平位置，并固定位置放好梳子，将冷却到65摄氏度左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶剂内槽放入电泳槽中，添加1XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3.加样：在点样版上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x，用1微升微量移液管枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应更换一个加样头，以防止污染，加样时五碰坏样品周围的凝胶面。

4.电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100伏特，样品由负极向正极方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离，范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1CM处时，停止电泳。

5.观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带采用凝胶成像系统拍照保存。

1.6.3蓝白斑筛选[4]设备：培养皿，移液器，x-gal，IPTG，氨苄青霉素药品配置：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖）:X-gal溶于N，N＇-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。