BOP基因的克隆及鉴定
不同荞麦品种落粒基因的筛选
不同荞麦品种落粒基因的筛选李雪;黄志强;姜君;陈庆富【摘要】为获得荞麦落粒性相关基因，分别选取甜荞、苦荞和金荞的不同品种不同组织混合样品进行转录组测序，通过数据库比对、功能分析与功能注释获取与落粒性相关的 Unigene。
设计引物通过 RACE 方法扩增候选基因，测序后将候选基因全长序列提交到 NCBI 数据库中，通过 blast 寻找候选基因的命名，用实时定量荧光 PCR 测候选基因的表达量。
结果表明：得到6个候选基因，其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like 蛋白基因、NPR5-like 蛋白基因主要在花器官的发育和形成过程中起调控作用，而 SRG1-like 蛋白基因、过氧化物酶基因和 AGL 蛋白基因主要在植物离区的形成和发育过程中起调控作用。
NPR5-like 蛋白基因在落粒品种与不落粒品种间的表达量差异最大。
结论：NPR5-like 蛋白基因在荞麦落粒过程中起一定的调控作用。
%Six candidate genes related to seed-holding character of buckwheat were determined from different tissue ofF.esculentum,F.tataricum and F.dibotrys by RT-PCR to obtain genes related to seed-holding character of buckwheat.The results showed that root phototropism protein gene,SOBIR1-like protein gene,and NPR5-like gene have the regulating effect on the floral organ development and formation process,but SRG1-like protein gene,peroxidase gene and AGL protein gene have the regulating effect on the development and formation process of abscission zone in buckwheat mainly. There is significant difference in expression quantity of NPR5-like gene between shattering buckwheat variety and non-shattering buckwheat variety,which indicates that NPR5-like protein gene has a certain regulating effect on seed shattering process in buckwheat.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】5页(P19-23)【关键词】荞麦;落粒性;转录组;实时定量荧光 PCR【作者】李雪;黄志强;姜君;陈庆富【作者单位】贵州师范大学，贵州贵阳 550001;贵州师范大学，贵州贵阳550001;贵州师范大学，贵州贵阳 550001;贵州师范大学，贵州贵阳 550001【正文语种】中文【中图分类】S517荞麦属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)[1]。
bop基因的克隆
四、目的基因的扩增和回收纯化
二. PCR产物的回收纯化
1．0.5g琼脂糖倒入50mlTAE电泳缓冲液，用电炉加热溶解，加一小滴EB 溶液，摇匀，稍冷却后倒胶 2．PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳后割取目的带，放于EP管中。 3．加500ul buffered-A混匀，于75℃水浴加热，混匀至溶胶完全溶解。 4．加250ul buffer DE-B,混合均匀，转入DNA制备管中，12000r离心1min, 弃滤液。 5．将制备管放回EP管中，加500ul buffer w1,12000r离心30s,弃滤液。 6． 放回，加200ul w2,12000r离心30s,弃滤液，用700ul w2 buffer洗涤一次， 12000r离心1min 7． 置于洁净的EP管中，在制备膜中央加25ul去离子水，室温静置10min， 12000r离心1min即DNA 8. －20℃保存备用。
七、重组质粒的转化与验证
一.转化 1.加20μl重组质粒Puc18-bop到50μl感受态细胞中,同时设三组 对照：
编号 1 2 3 4 组别 质粒DNA ----------20μl 20μl 20μl 感受态细胞 ----------50μl ----------50 空白对照 Puc19+感受 态细胞 质粒对照 转化实验组
生物技术综合实验
Bop基因的克隆
一、实验目的
将质粒Puc19中bop基因导入质粒Puc18(载体)中构 建Puc18-bop重组质粒，再将重组质粒导入到大肠 杆菌DH5α中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定， 初步证实实验是否实现了bop基因的克隆
二、实验步骤
SDS碱裂解法制备小量质 粒
目的基因的扩增 和回收纯化
五、DNA的酶切
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析
乳糖酶基因的克隆及生物信息学分析【摘要】目的：克隆并分析保加利亚德氏乳杆菌中的乳糖酶基因。
方法：利用PCR技术从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出乳糖酶基因、测序并生物信息学分析。
结果：成功的从保加利亚德氏乳杆菌中克隆出全长为3 024 bp的乳糖酶基因，利用生物软件分析，推测乳糖酶基因共编码1 008个氨基酸，蛋白分子量为114 KDa，等电点为4.9，氨基酸序列中共有9处潜在的糖基化位点。
并将此基因与不同来源的乳糖酶基因进行同源性比较。
结论：成功的克隆出乳糖酶基因，并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。
了解该酶的性质特征，为进一步研究及低成本表达该酶奠定基础。
【关键词】乳糖酶基因；克隆；生物信息学分析［ABSTRACT］ Objective: To clone and analyze lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus. Methods: Cloned lactase gene from Lactobacillus delbrueckii bulgaricus with PCR, made sequencing and bioinformatics analysis. Results: Cloned lactase gene (3 024 bp) successfully. It was presumed that the lactase gene encode 1 008 amino acids, with protein molecule 114 KDa, isoelectric point 4.9, 9 potential glycosylation sites in amino acid sequence. Made homology comparison with other lacteses. Conclusion: The lactase gene is cloned successfully and the bioinformatics analysis is made by biological analysis software to investigate its character. It provides foundationfor further study and colonization at low cost.［KEY WORDS］ Lactase gene; Clone; Bioinformatics analysis 乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，还含有免疫球蛋白等抗病因子，易被人体消化吸收，是人类改善营养、增强体质的理想食品［1］。
Bop基因的克隆
B op基因的克隆摘要目的：通过选择克隆型载体pUC18为构建重组质粒的载体，质粒pUC19中的细菌视紫红质基因bop为目的基因，利用分子生物学相关技术构建pUC18－bop重组质粒，再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验是否实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。
方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取克隆型质粒载体pUC18和含细菌视紫红质基因bop的质粒pUC19，分别用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后,在紫外透视仪上取酶切后pUC18质粒和Bop基因，在T4连接酶作用下，16℃恒温水浴过夜连接，再将连接后的产物导入到制备好的感受态细胞，将转化后的产物接种到含氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板，37℃恒温培养箱培养过夜，最后，挑取单菌落经PCR 扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳筛选阳性单克隆。
结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测后，初步断定已分离提纯出不含蛋白质、RNA、脂质等杂质PUC18、PUC19质粒。
酶切产物经电泳检测发现，PUC18只产生了一条荧光带，PUC19产生了两条荧光带，初步断定光带1是PUC18,光带2是Bop基因，可利用泳道②上的光带和泳道③上的光带1进行连接实验。
转化结果检测显示可直接从已形成菌落的平板中挑取单菌落进行PCR扩增实验。
最后，PCR回收产物检测，两泳道中的光带都位于1000-2000之间，与预测的bop基因电泳所处位置相符，初步断定bop 基因已成功转入到宿主细胞。
结论：成功构建pUC18－bop重组细菌视紫红质基因，经特异性PCR扩增鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop 基因）的克隆。
关键词：Bop基因；pUC18质粒；琼脂糖凝胶电泳；PCR聚合酶链反应1 前言1.1Bop基因视紫红质是一种含视黄醛的膜蛋白，它位于动物视觉器官的感光细胞中，接受光讯号转变为电讯号。
青花菜病程相关蛋白基因BOPR1的克隆与表达分析
青花菜病程相关蛋白基因BOPR1的克隆与表达分析作者：何佳葛露霞金魏佳范灵希章燕如叶佳燕郑颖蒋明来源：《福建农业学报》2018年第01期摘要：病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）是参与植物抗病性的重要物质，在诱导系统抗性过程中起着重要作用。
本研究以青花菜为材料，在克隆BoPR1基因的基础上，利用荧光定量PCR技术研究它们在根肿菌和核盘菌侵染下的表达模式。
序列分析结果表明，BoPR1基因组全长为489 bp，无内含子，编码162个氨基酸，具1个信号肽和1个SCP结构域。
系统发育分析的结果表明，BoPR1与甘蓝型油菜和白菜的PR1遗传距离最小，亲缘关系最近，在进化树上聚为一组；与醉蝶花PR1遗传距离最大，亲缘关系最远。
荧光定量PCR结果显示，BoPR1基因的表达受根肿菌诱导，在接种5d时的表达量最高，为对照的11.84倍；BoPR1基因的表达则不受核盘菌诱导。
关键词：青花菜；BoPR1；基因克隆；表达分析青花菜Brassica oleracea var.italica又名西兰花、茎椰菜、绿菜花和青花苔等，为十字花科CrUCiferae芸薹属一年生或两年生草本蔬菜。
青花菜以花茎和花球为食用部位，因富含蛋白质、维生素、矿物质、类黄酮和硫苷类等物质，深受消费者的青睐。
浙江省是我国青花菜的主产省，年种植面积达1万多h㎡，已成为菜农收入的重要来源。
随着种植年限的不断增加，各种病害如根肿病和菌核病等日益严重，它们危害根、茎、叶或花球，造成青花菜的产量和品质下降。
植物在长期的进化过程中，形成了一整套高度有效的防御机制，在与病原菌的互作过程中，植物通过启动抗病相关基因的表达以增强抵抗能力。
病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）基因是参与这一过程的重要成员，在植物诱导抗性中起着重要作用。
PR基因的诱导、表达及其生物学功能的发挥是一个较复杂的过程，研究其在不同病原菌胁迫下的表现具有十分重要的意义。
中华蜜蜂OBP3基因的克隆_原核表达及组织表达谱_吉挺
昆虫学报Acta Entomologica Sinica，August2014，57（8）：897－904ISSN0454-6296中华蜜蜂OBP3基因的克隆、原核表达及组织表达谱吉挺1，沈芳1，梁勤2，吴黎明3，刘振国1，罗岳雄4（1．扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009；2．福建农林大学蜂学院，福州350002；3．中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093；4．广东省昆虫研究所，广州510260）摘要：【目的】气味结合蛋白质（odorant binding proteins，OBPs）参与气味分子的识别，在蜜蜂嗅觉中扮演重要的角色。
本研究旨在克隆中华蜜蜂Apis cerana cerana OBP3基因，以制备多克隆抗体。
【方法】运用ＲT-PCＲ技术从中华蜜蜂头部总ＲNA中扩增OBP3基因，将该基因亚克隆入原核表达载体pET-28a并转入大肠杆菌Escherichia coli Ｒosetta（DE3）中诱导表达获得融合蛋白质，融合蛋白质经纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，最后分别用间接ELISA和Western Blot检测抗体的效价和特异性，并采用荧光定量PCＲ检测OBP3基因在中蜂不同组织中的表达。
【结果】克隆得到了中华蜜蜂OBP3基因AccOBP3（GenBank登录号KJ026357），大小为444bp。
SDS-PAGE结果显示融合蛋白成功表达。
制备的多克隆抗体效价高于1ʒ40000，且具有很高的特异性。
荧光定量PCＲ结果表明，AccOBP3基因在腿部和触角中显著高表达（P＜0．01），胸部中次之（P＜0．01），头部和腹部中显著低表达，后两者表达量差异不显著（P＞0．05）。
【结论】OBP3基因在中蜂触角有高转录活性。
本研究实现了中蜂OBP3基因的原核表达，并制备了兔抗中蜂OBP3多克隆抗体，为深入研究中蜂OBP3基因的功能奠定基础。
关键词：中华蜜蜂；OBP3基因；基因克隆；原核表达；组织表达谱；抗体制备中图分类号：Q966文献标识码：A文章编号：0454-6296（2014）08-0897-08Cloning，prokaryotic expression and tissue expression profiling of an OBP3gene in the Chinese honeybee，Apis cerana cerana（Hymenoptera：Apidae）JI Ting1，SHEN Fang1，LIANG Qin2，WU Li-Ming3，LIU Zhen-Guo1，LUO Yue-Xiong4（1．College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu225009，China；2．College of Bee Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou350002，China；3．Institute of ApicultureＲesearch，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100093，China；4．Guangdong Entomological Institute，Guangzhou510260，China）Abstract：【Aim】Odorant binding proteins（OBPs）are involved in the identification of odor molecules，and play an important role in bees’olfaction．This study was designed to clone and express an OBP3 gene from the Chinese honeybee Apis cerana cerana，in order to prepare the polyclonal antibody．【Methods】The OBP3gene was amplified byＲT-PCＲfrom totalＲNA from head of A．cerana cerana，then sub-cloned into prokaryotic expression vector pET-28a and expressed in Escherichia coliＲosetta （DE3）host cells．The fusion protein was purified and immunized into New Zealand white rabbits so as to prepare polyclonal antibody．The sensitivity and specificity of the polyclonal antibody were detected through indirect ELISA and Western blot，respectively．The expression profiles of AccOBP3in different tissues were detected by real-time quantitative PCＲ．【Ｒesults】AccOBP3（GenBank accession no．KJ026357）was cloned and a444bp fragment was obtained．The recombinant vector pET-OBP3was successfully constructed．SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein was well expressed．The anti-OBP3polyclonal antibody showed high titer（higher than1ʒ40000）and specificity．Ｒeal-time quantitative PCＲresults showed that the expression level of AccOBP3gene was significantly higher in legs and antennae（P＜0．01），moderate in thorax，and significantly lower in heads and abdomen（P＜基金项目：国家自然科学基金项目（31372382）；国家蜂产业技术体系（CAＲS-45-SYZ6）；江苏省科技支撑计划课题（SBE201230535）作者简介：吉挺，男，1974年生，江苏东台人，博士，副研究员，研究方向为蜜蜂遗传资源调查分析和保护，E-mail：tji@yzu．edu．cn收稿日期Ｒeceived：2014-03-28；接受日期Accepted：2014-05-28898昆虫学报Acta Entomologica Sinica57卷0．01）．The expression level of AccOBP3in heads and abdomen had no significant difference（P＞0．05）．【Conclusion】The OBP3gene has high transcript expression in the antennae of A．cerana cerana．In this study，AccOBP3gene has been cloned and expressed，and the rabbit anti-ApisCeranaOBP3polyclonal antibody has been prepared by immunization with the purified recombinant OBP3protein，which lays the foundation for further studies on functions of OBP3gene．Key words：Apis cerana cerana；OBP3gene；gene cloning；prokaryotic expression；tissue expression profiles；antibody preparation特殊的嗅觉系统对于昆虫有着重要的作用，昆虫通过嗅觉感受器来获取环境中的气味信息，将化学信号传递到被激活的大脑中枢神经元中，进而调节昆虫相应的行为，如觅食、交配、产卵、同族识别及躲避敌害等（Ｒobertson et al．，2003；Swanson et al．，2009）。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
“十三五”我国青花菜遗传育种研究进展
“十三五”我国青花菜遗传育种研究进展李占省 刘玉梅 韩风庆 方智远 张扬勇 杨丽梅 庄 木 吕红豪 王 勇 季家磊（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：“十三五”期间，我国青花菜遗传育种研究快速发展并取得了重要研究进展，选育出一批优异的青花菜新品种和育种资源，雄性不育制种瓶颈得以突破，国产青花菜新品种的市场占有率由2010年的不足5%提升至当前的15.36%，应用基础研究快速发展，遗传育种技术已达到国际先进水平。
本文从青花菜种质创新、新品种选育、育种技术等方面系统综述了2016年以来我国的科研成果和科研进展，并提出了青花菜产业存在的潜在问题及未来发展趋势。
关键词：青花菜；遗传育种；新品种；育种技术；研究进展种28个，地方认定4个，申请新品种权23件，发表科研论文59篇，其中SCI 收录18篇，分别发表在《中国农业科学》《园艺学报》等国内核心期刊以及国际园艺及生物学知名期刊Theoretical and Applied Genetics （TAG ）、BMC 、Frontiers in Plant Science 、PLoS One 、Molecular Breeding 等。
“十三 五”期间，我国青花菜遗传育种主要科研育种单位有中国农业科学院蔬菜花卉研究所、北京市农林科学院蔬菜研究中心、天津科润蔬菜研究所、浙江省农业科学院蔬菜研究所、上海市农业科学院园艺研究所、江苏省农业科学院蔬菜研究所和台州市农业科学院园艺研究所等；主要育种企业有浙江美之奥种业股份有限公司、武汉亚非种业有限公司、温州肇丰种苗有限公司、天津惠尔稼种业科技有限公司和浙江神良种业有限公司等。
“十三五”期间，在青花菜优异种质资源筛选与鉴定、主流病害鉴定、营养成分分析，以及在细胞工程（单倍体育种）、雄性不育改良与利用、分子标记辅助选择、DNA 指纹图谱构建及组学技术等领域建立了完善的技术体系，推出具有市场竞争力的青花菜新品种30多个，市场占有率提升至15%～18%。
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Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。
通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。
关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章1.前言1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。
是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。
重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。
广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。
是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。
广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。
广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。
---基因工程产业化的基本原则。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。
从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。
这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。
基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。
[1]1.2 PCR技术基本原理PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。
类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[2] 1.3 感受态细胞感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。
由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
[2]1.4 酶切鉴定实验在重组质粒构建，重组质粒pUC18-bop采用BamH I、Hand Ⅲ双酶切鉴定，在对双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图中可以看到所得条带都不是很清晰，有拖尾现象出现。
这可能由于未待胶完全凝固时加样了；重组质粒条带有明显拖带出现，这与质粒提取，提纯操作有关！但可以看出其分子量同bop 基因分子量（1200bp左右）一至。
酶切能进一步证实bop基因的成功克隆。
但就实验设计来看，为更清晰看到双酶切前后及PCR扩增片段与bop基因区别，笔者建议将克隆载体pUC18质粒，PCR扩增产物，酶切后的克隆载体及目的基因在一块琼脂糖凝胶上电泳。
【2】2实验材料与仪器2.1实验材料2.1.1 生物材料大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,克隆载体pUC 18由武汉大学东湖分校生物技术实验室保存，含bop基因的pUC 19质粒的大肠杆菌由武汉大学东湖分校金卫华老师提供。
2.1.2 生化材料T4DNA连接酶，BamH I及HindⅢ核酸内切酶等均购自大连Takara公司，氨苄青霉素（Amp）购自上海生工公司，Marker购自Fermentas公司，电泳用琼脂糖及细菌培养用琼脂均购自晶美公司。
DNA回收试剂盒购自MBI公司。
2.2主要实验试剂2.2.1 LB液体培养基：精确称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCI lg放入烧杯内，加蒸馏水充分溶解后定容至100mL，121℃高压下蒸汽灭菌20min。
储存于4℃备用。
2.2.2 LB固体培养基：取配置好的未高压蒸汽灭菌的LB液体培养基50ml加入细菌培养用琼脂(Bacto－Agar)0.5g，混匀后121℃高压蒸汽灭菌20min。
储存于4℃备用。
2.2.3 碱性裂解液Ⅰ：精确称取葡萄糖0.495g，Tris碱0.0303g，二水乙二胺四乙酸二钠0.146g与小烧杯中，用蒸馏水充分溶解后定容至50ml。
2.2.4 碱性裂解液Ⅱ：精确移取0.2mol/L的NaOH 20μL，1％的SDS 20μL，加蒸馏水160μL混匀。
(注意:0.2mol/L的NaOH和1％的SDS分开配,临时混合用)2.2.5 碱性裂解液Ⅲ：精确移取5mol/L的乙酸钾30ml，冰乙酸5.8ml，加入蒸馏水并定容至50ml。
2.2.6 上样缓冲液：精确称取溴酚蓝2.5mg，加入60％甘油0.6ml，50％EDTA0.5g，摇匀后加蒸馏水至1ml。
2.2.7 0.1mol／L CaCl2：精确称取1.19无水CaCl2定容至100ml，121℃，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，4"C保存。
2.2.8 灭菌蒸馏水：蒸馏水水分装后121℃高压蒸汽灭菌后，4℃保存备用。
2.3主要实验仪器洁净工作台（等级：100级，上海博迅实业有限公司医疗设备）高速离心机（D-37520，sigma）电子天平（JY2002，上海衡平仪器仪表厂）分析天平（AUY120,SHIMADZU）数显鼓风干燥箱（GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）MJ-300BS-Ⅱ霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）超速离心机（D-78532 Tuttlingen，Hettich）微量加样枪凝胶成像系PCR仪恒温振荡器（CHA-S，国华企业）稳压稳流电泳仪（JY-600PJ，北京君意东方）调速多用振荡器（HY-4，国华电器有限公司）美的电冰箱（美的集团电冰箱制造有限公司）3实验方法3.1菌种活化（1）LB培养基的配置称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。
完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。
向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。
（2）灭菌将枪头、50mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121℃灭菌20min.（3）无菌接种在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。
培养基凝固后，分别划线接种含PUC18 、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。
平板倒置放在37℃培养箱中培养过夜。
（4）挑单菌落在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.充分混匀后，分装于10支试管中，每支试管各5ml。
用镊子取无菌牙签挑取1、2平板上的单菌落，接种于于5ml LB含氨卞青霉素（0.1g/ml）的液体培养基内，37℃，250rpm，恒温摇床振荡增殖培养过夜。
3.2 SDS碱裂解法制备质粒（1）细菌收集用微量移液枪各取1mL两种菌液至1.5ml EP管内做好标记，6 000 rpm离心3min，弃尽上清液。
再次取样1mL菌液至同一EP管内，重复离心，留沉淀。
（2）细菌裂解向上述沉淀中加入100μL冰预冷的碱裂解液Ⅰ，强烈振荡混匀（用移液枪吹打）至菌悬液完全浑浊；加入200μL新配置的碱裂解液Ⅱ于菌悬液中，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4-5次，但切勿振荡，冰浴约5min，至瓶盖下出现粘稠丝状物为止；再加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖严管盖，温和振荡数次，冰浴5min。
（3）提取质粒10 000rpm 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5mL EP管中。
（4）质粒纯化向上述上清中加入等体积酚氯仿(1:1)，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；向上述上清中加入等体积的异丙醇，轻微振荡后摇匀，室温静置5min；10000rpm离心10min，去上清，向EP管中加入70%酒精200μl，盖紧管口，颠倒几次，10 000rpm离心2min，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干至沉淀变透明。
重复以上操作，再制备等量两种菌种的纯化质粒各一支，分别标记PUC18 、PUC19。