阳性克隆的PCR鉴定
阳性克隆鉴定和质粒DNA提取
确保质粒DNA的质量和纯度，可以提高阳性克隆鉴定的准 确性，为后续实验提供可靠的基因材料。
推动基因工程领域的发展
对阳性克隆鉴定与质粒DNA提取的关联性进行深入研究， 有助于推动基因工程领域的发展，为基因治疗、基因编辑 等应用提供技术支持。
05
实验设计与操作注意事项
实验设计原则
明确实验目的
根据研究目标选择合适的克隆鉴定和质粒DNA提取方 法。
选择合适载体
根据实验需求选择合适的载体，如质粒、噬菌体等。
设计引物
针对目标基因设计特异性引物，用于PCR扩增和测序 验证。
操作注意事项
无菌操作
精确计量
控制温度和时间
实验过程中需保持无菌 操作，避免污染。
准确称量试剂和样品， 保证实验结果的准确性。
团队协作
实验过程中，团队成员积极沟通、协作，共同解决遇到的问题，提高了实验效率。
不足之处
在实验过程中，我们也遇到了一些问题，如PCR扩增效率不高、质粒提取量不足等。这些 问题提醒我们在后续实验中需要更加注意细节，优化实验条件。
未来工作展望
深入研究
在后续实验中，我们将进一步研究重组质粒的功能和表达情况，以及其在细胞内的稳定性和传递 效率等问题。
严格控制实验过程中的 温度和时间，避免对实
验结果产生影响。
防止交叉污染
使用一次性枪头和离心 管，避免交叉污染。
实验结果记录与数据分析
详细记录实验步骤和数据
记录实验过程中的操作步骤、试剂用 量、温度、时间等关键信息。
数据分析
对实验结果进行统计分析，如PCR产 物电泳图谱分析、测序结果比对等。
结果解读
鉴定步骤
01
PCR法直接筛选重组阳性克隆
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90
个循环 ,1 %琼脂糖凝胶电泳检测 。 7. 质粒 PCR 鉴定阳性克隆 从无菌接种环取样
后的阳性克隆中挑取单个菌落 ,按常规碱裂解法提取 小量质粒 DNA[4 ] ,取 1 μl 质粒 DNA 作模板 ,用菌落 PCR 相同的引物 ,进行 PCR 扩增 。
8. Pst Ⅰ酶切鉴定阳性克隆 取质粒 DNA 10μl , Pst Ⅰ内切酶 10 U ,补足水至反应体积 20μl ,37 ℃恒温 水浴过夜 ,进行 Pst Ⅰ内切酶酶切鉴定 。
3 姜 宏 ,李麓芸 ,卢光 . 小鼠生精细胞凋亡相关基因的分 子克隆. 生物化学与生物物理学报 ,2001 ;33 (4) :421～425
4 姜 泊 ,张亚历 ,周殿元主编. 分子生物学常用实验方法. 北 京 :人民军医出版社 ,1996 :3～4
5 Sat he GM ,O’Bfien S , Mclaughlin MM , et al. Use of poly2 merase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells. Nucleic Acids Res , 1991 ;19 :4775 (2004204219 收稿)
阳性转化子的鉴定
（1）建议挑(而不仅仅是三四个克隆，PCR鉴定可挑12（12-20）个阳性克隆），一般情况下会挑到正确的目的克隆。
（2）减少转化后预温育时间（未加抗生素）。
因为在未加抗生素情况下，延长温育时间可能会导致单个突变克隆的扩增。
（3）挑克隆时，应挑选分隔良好、新鲜、边缘光滑、不太大的单菌落。
鉴定阳性重组子：无论是酶切抑或是PCR鉴定，均采用克隆引物的PCR产物作为鉴定克隆对照。
根据所需酶价格差异，酶切鉴定成本约3-5元/反应（加上后续测序鉴定则为5-8元/反应）。
①酶切鉴定10微升酶切体系，每个阳性克隆摇菌抽提所得质粒加酶0.10微升酶切4-5h。
②菌落PCR (菌液PCR)（1）挑选白色克隆至10微升无菌水中，涡旋混合。
（2）取1微升混合液加至20-30微升PCR体系。
【注】可先负20度冷冻，然后煮沸或者95度裂解5-10分钟，再混匀吸取1微升混合液加至20-30微升PCR体系。
目的克隆占阳性克隆比率低（<20%）的情况尽量用菌液PCR鉴定。
PCR的95℃加热可以破胞，释放基因组DNA或质粒。
挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增；使使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增；反应的循环数也不能太多，一般为【注】TAQ MIX PCR鉴定2.5-3.0元/反应。
模板用量参考值：20微升体系+1.0微升菌液（0.5-2.0微升）或0.20微升质粒(10-100ng，30ng)。
③测序测序鉴定16元/反应。
目的克隆占阳性克隆比率50%连接产物经切空载处理(如shRNA载体)：挑取【注】pSUPER 24/24；pMIR 23/23；24/40。
NCBI 在线BLAST 测序序列。
（基因组）&（载体）。
菌落PCR
菌落PCR菌落PCR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于，直接以单个菌作为模板。
是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。
操作简单，快接，阳性率较高，在转化鉴定中较常见。
操作方法：1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。
现在含抗性的平板上画线，做保种用，然后置于20ultriton－x100中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号2，将装有20ulTritonx－100的EP管100度煮2分钟3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR体系，建议做20ul体系，模板加煮过的菌的上清1ul 4，上机即可。
退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推荐比质粒PCR 时稍低5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序都可以方法细节：用枪头挑选单菌落到装有20uL水的pcr管中，然后悬浮菌液。
在做PCR时，吸取1uL做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液10uL与试管的液体培养基中培养。
这样做，既初步检测了阳性克隆，又保存了所需要的菌落。
当然，在挑菌时也有用接种环挑的，有用牙签挑的，看个人的爱好了我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。
想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用1.5的EP管装1mL左右培养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR反应体系中。
把PCR体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以上机P了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。
取200ul水，牙签挑菌，煮沸5‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul做模版。
其他的和普通pcr一样。
我们都是用过夜培养的菌液0.3ul（不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它都不变。
先94度5min 裂解菌，最好5min后再加入taq酶。
是的，菌落PCR不难。
但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱的条带出现，最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了1个月。
基因编辑中的阳性细胞鉴定方法
基因编辑中的阳性细胞鉴定方法基因编辑是一种通过改变细胞或生物体的基因组来修改其基因功能的技术。
而基因编辑中，阳性细胞鉴定方法是一种用于确定基因编辑是否成功的重要步骤。
本文将介绍基因编辑中的阳性细胞鉴定方法，并讨论其原理、优缺点以及应用前景。
在基因编辑中，阳性细胞鉴定方法主要用于确定基因编辑是否成功并筛选出受编辑影响的细胞。
一般情况下，基因编辑技术会通过引入特定的核酸修饰物或蛋白质来改变细胞的基因组。
而阳性细胞鉴定方法则通过检测这些改变来确定编辑是否成功。
目前广泛应用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统和基因载体介导的编辑技术。
针对这些技术，有几种常用的阳性细胞鉴定方法可供选择。
首先，最常见的阳性细胞鉴定方法之一是PCR（聚合酶链反应）。
PCR是一种快速、高效的检测技术，可以扩增目标DNA序列。
在基因编辑中，PCR可用于扩增被编辑的基因或位点，以验证是否存在编辑导致的变化。
此外，可以添加特定的引物来扩增只存在于编辑细胞中的DNA片段，用于鉴定阳性细胞。
其次，流式细胞术也是一种常用的阳性细胞鉴定方法。
流式细胞术通过检测细胞表面或内部的特定标记物来鉴定和分离不同类型的细胞。
在基因编辑中，可以通过标记编辑所引入的标记基因（如绿色荧光蛋白）来识别编辑成功的阳性细胞。
流式细胞术具有快速、高通量的优势，可用于大规模筛选阳性细胞。
此外，细胞克隆和序列分析也是常用的阳性细胞鉴定方法。
细胞克隆是一种将单个细胞扩增为克隆系列的方法，可以通过对克隆细胞进行PCR、测序等技术来鉴定阳性细胞。
而序列分析则通过测定和比较DNA序列来确定是否存在编辑。
以上的方法各有优缺点。
PCR方法简单、快速，但无法提供细胞级别的信息。
流式细胞术可以高通量地鉴定阳性细胞，但需要特殊的设备和专业的技术支持。
细胞克隆和序列分析可以提供高精度的鉴定结果，但耗时较长且操作复杂。
随着基因编辑技术的不断发展，阳性细胞鉴定方法也在不断完善和创新。
近年来，一些新兴技术如基于CRISPR的阳性筛选系统（如基于CRISPR-Cas9的激活子系统和座子系统）被引入。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
克隆基因提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习并掌握克隆基因提取的基本原理和操作步骤，通过实验操作，提取目的基因，为后续的基因克隆、表达和功能研究奠定基础。
二、实验原理克隆基因提取主要利用DNA提取技术，通过破碎细胞、释放DNA、去除杂质等步骤，得到高纯度的DNA。
本实验采用碱裂解法提取目的基因，该方法具有操作简单、提取效率高、DNA纯度好等优点。
三、实验材料1. 实验试剂：NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、无水乙醇、异丙醇、二苯胺染液、DNA提取试剂盒等。
2. 实验仪器：高速离心机、电子天平、移液器、PCR仪、凝胶成像系统等。
3. 实验样品：目的基因载体（含目的基因）、细菌菌液等。
四、实验步骤1. 细菌培养：将目的基因载体转化至大肠杆菌，挑取单克隆菌落，接种于含有适量抗生素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养过夜。
2. 酵母提取物制备：将过夜培养的菌液按1:100比例稀释，加入酵母提取物、葡萄糖等，37℃、200 r/min培养至对数生长期。
3. 细菌裂解：将培养好的菌液按照1:10比例加入裂解液，55℃水浴30 min，期间每隔5 min振荡1次，使菌体充分裂解。
4. DNA沉淀：将裂解液按照1:2比例加入等体积的异丙醇，混匀，4℃、12 000r/min离心10 min，弃上清液。
5. DNA洗涤：将沉淀用70%乙醇洗涤1次，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清液。
6. DNA溶解：将沉淀用适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。
7. DNA纯化：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到高纯度的目的基因。
8. 验证：将提取的目的基因进行PCR扩增，观察扩增结果，确认目的基因提取成功。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得目的基因，扩增产物大小与预期相符。
2. DNA纯度：利用NanoDrop2000检测提取的目的基因，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。
酵母菌表面展示操作步骤之筛选与鉴定效果
酵母菌表面展示操作步骤之筛选与鉴定效果酵母菌表面展示（Yeast Surface Display）是一种把外源蛋白质或肽链表达在酵母菌表面的技术。
该技术可实现酵母菌作为细胞工厂来展示多种不同的蛋白质，从而用于各种领域的研究和应用，如蛋白质工程、药物筛选、抗体发现等。
本文将介绍酵母菌表面展示的筛选与鉴定效果的操作步骤。
一、构建表达载体1. 选择合适的酵母菌表达系统，如常用的Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）。
2. 获取目标蛋白质的基因序列，并设计适当的引物进行PCR扩增。
3. 将扩增得到的基因片段与酿酒酵母表达载体连接，产生酵母表达构建。
二、转化酵母菌1. 将表达构建转化到酿酒酵母细胞中。
2. 选择适当的培养基供酵母菌生长，如YPDA培养基。
3. 使用电穿孔或锂醋酸法将表达构建导入酵母细胞。
三、表达目标蛋白质1. 在含有糖、氮源以及其他必需物质的培养基中培养酵母细胞。
2. 优化培养条件，如温度、培养时间和含量参数，以提高目标蛋白质的表达量。
四、筛选与鉴定1. 根据目标蛋白质的性质，选择适当的方法进行筛选。
常用的方法包括：- 流式细胞术（FACS）：通过流式细胞仪筛选具有目标蛋白质表面展示的酵母细胞。
- 免疫沉淀：利用特异性抗体或亲和标签对表面展示的蛋白质进行沉淀，然后进行分析。
- 细胞接合：将表面展示目标蛋白质的酵母细胞与靶细胞进行接合，观察相应的识别与结合情况。
2. 筛选后，对得到的阳性克隆进行鉴定。
可通过PCR、Western blot或其他适当的方法分析目标蛋白质的表达与功能。
五、进一步改良与评估1. 对筛选到的阳性克隆进行进一步改良与优化，以提高目标蛋白质的展示效果。
2. 可进行亲和性和特异性的评估，如对目标蛋白质的亲和性进行测定，或测试其与特异配体的结合强度。
六、应用领域酵母菌表面展示技术广泛应用于以下领域：1. 蛋白质工程：通过酵母菌表面展示技术，可筛选出具有特定功能的蛋白质，如酶、抗体和受体分子。
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PCR反应参数:退火
•引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基 组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物 的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约 低5℃，时间一般为30-45sec。
PCR反应参数:延伸
•延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适 反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因 为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.
PCR反应体系-模板DNA
•就模板DNA而言, 影响PCR的主要因素是模板的数量和 纯度. 一般反应中的模板浓度为 50-100 ng/ml. •模板量过多则可能增加非特异性产物. DNA中的杂质也 会影响PCR的效率.
PCR反应体系— PCR反应缓冲液
•缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg 2+ .
•另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或 100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性。
•加入T4噬菌体的基因32蛋白，对扩增较长的DNA片段 有利。
PCR反应参数:变性
•在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可 使模板DNA完全解链。变性不完全,往往使PCR失败, 因为未变性完全的 DNA双链会很快复性,减少DNA产 量。
•引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低 都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链 的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量 不能相差太大。
•一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。 引物过• dNTP应用NaOH 将pH调至7.0。 dNTP原液可配成 5-10mmol/L并分装, -20℃贮存。一般反应中每种 dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 • 理论上4 种 dNTP各20μmol/L, 足以在100μl反应中合 成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可 抑制Taq DNA聚合酶的活性. •4种dNTP的浓度应该相等, 以减少合成中由于某种 dNTP的不足出现的错误掺入。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)，是 一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。
➢1.变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键 断裂，形成单链DNA，称之为变性。
➢2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序 列互补的一小段DNA片段。
➢3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点， 将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着 模板顺序合成新的DNA链。
阳性克隆的PCR鉴定
一、实验目的 掌握利用PCR技术对阳性克隆的检测技术 掌握PCR技术的原理和方法
二、相关基本知识
DNA聚合酶Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初 期由Dr. H. Klenow 所发现，但此酶不耐高温。现今所使 用的酶( Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌 分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR反应体系- Mg2+
•Mg 2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大, 它可影响酶 的活性和真实性, Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性; Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。
•Mg 2+浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚 体的形成等。
•通常Mg 2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L, 1.5mM最佳。
✓PCR产物生成量是以指数方式增加的，能
将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到 微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出 一个靶细胞；对细菌的最小检出率为3个。
✓PCR不需要分离病毒或细菌及培养细胞，
DNA粗制品即可作为扩增模板。可直接用临床 标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、 活组织等粗制的DNA扩增检测。
PCR反应体系- Taq聚合酶
扩增效率最高, 1000 bp/min •活性 5‘-3’ DNA聚合酶活性 强 无3‘-5’ DNA外切酶活性 错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆
•pfu酶——保真度高 •原理: 具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。 效率相对较低, 500 bp/min •3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。
PCR于1983由K. B. Mullis发展出的，Dr. Mullis 并于1985 年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其 它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床 应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。 Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
•引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有 较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其 他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基 A。另外，两条引物3’端若互补，或者单条引物自 身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。
•5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修 饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位 点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入 突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通 常应在5‘端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
PCR反应体系
➢ 引物 ➢ dNTP ➢ Mg2+ ➢ Taq聚合酶 ➢ 模板 ➢ 反应缓冲液
引物设计的基本原则：
•引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp， 但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大 于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
•引物序列3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。