荧光定量PCR、基因克隆和基因测序

临床分子生物学

1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。

（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。

荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。

（2）方法：

1、引物设计遵守的原则

2、探针设计遵守的原则

3、RNA提取

4、逆转录逆转录成cDNA

5、常规PCR扩增

（1）反应体系

（2）混匀，瞬时离心。

（3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。

（5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。

6、 实时荧光定量PCR扩增目的基因

用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μl，分别加入30μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。

反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。

将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。

7、基因相对拷贝数的检测与计算

8、统计学分析

（3）注意事项：

A、在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管的底部。

B、在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境的污染。

C、操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。

D、实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。

E、荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。

F、配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。

G、配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。

（4）在临床与科研中的应用：

? 定量检测

– 绝对定量

? 病原体检测

? 转基因食品检测

? 基因表达研究

– 相对定量

? 基因在不同组织中的表达差异

? 药物疗效考核

? (一) HBV 的检测

? FQ-PCR可及时、准确地检测出标本中HBV的拷贝数。研究证实，当HBV-DNA大于105拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。另外HBV-DNA 定量检测也可及时灵敏地监测患者药物治疗的效果。FQ-PCR 技术还可用于多种细菌、病毒、支原体、衣原体的检测，如人巨细胞病毒(HCMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、结核杆菌(TB)、解脲脲原体(UU)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NCG)、人乳头瘤状病毒(HPV)等。目前临床上正开展越来越多的基于FQ-PCR 的检测项目。

? (二) 染色体病的诊断

? 1999年Lo等利用荧光定量PCR技术，分别对从香港和波士顿两个中心收集的怀有21-三体胎儿母亲的血液中胎儿细胞游离 DNA进行定量检测。用胎儿Y染色体上的一段序列作为分子标记，运用定量PCR进行扩增，β球蛋白基因作为血浆DNA扩增的阳性对照。结果发现，在波士顿收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离 DNA的水平是正常对照的1.97倍；在香港收集的标本中21-三体胎儿母血中胎儿游离DNA的水平是正常对照的2.46倍。说明染色体异常的胎儿其母体血液中细胞游离DNA的水平较正常胎儿的母亲血液中的细胞游离DNA水平增高。但是这种方法仅限于男性胎儿，对于女性患儿无特异性，尽管如此，它仍为无创性染色体异常的产前诊断提供了一种新的思路。

? (三) 单基因病的诊断

? 在单基因病的诊断方面，对于基因的大片段缺失可设计跨基因片段的荧光探针，然后对其进行扩增。若有基因缺失，将无荧光的产生。

? (四) 基因表达的研究

? 实时荧光定量PCR的灵敏度可检测到400个分子的mRNA，它以其精确、快速、污染小,已广泛应用于分子遗传学领域。有的学者通过检测肿瘤相关癌基因表达的水平来判断肿瘤的微转移或预后。

? (五) 基因突变及其多态性

? 荧光定量PCR运用特异性荧光探针和杂合曲线分析，用来检测突变则省事、省时、无污染，在大批量的标本检测时其优势更加明显。

? (六) 其他方面的应用

? 1. 法医学应用 FQ-PCR已经开始应用于法医学个人识别和亲子鉴定，可检测微量及降解DNA，快速、简便、识别率高。目前已有对血痕、精斑、毛发、骨及其它组织DNA 分型的研究和应用于个人识别及亲子鉴定的成功报道。

? 2. 肿瘤学研究

? 意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。

1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。

? 3. 免疫组群分析

? 对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。

2.基因克隆技术的原理与方法是什么？在医学上有何意义？

（1）原理与方法：

基因克隆(gene cloning)或DNA分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。

基因克隆技术包括了一系列技术，可概括为∶分、切、连、转、选。

“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；

“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；

“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；

“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。

根据目的基因的不同信息状态，可选择以下方法：

（2） 在医学上的意义：

在医学领域，基因克隆主要用于致病基因的克隆与鉴定分析、已知基因的克隆与表达和定位克隆等方面。例如，可用于同种或异种器官移植、进行药物和生物制品的生产以及生物遗传疾病的预防、治疗和研究等。

同种方面：利用克隆技术培植人体皮肤进行植皮手术，尤其适用于皮肤大面积受损的患者。 异种方面：①基因敲除。转基因过程中，外源基因插入到染色体中可能导致某内源基因失活，形成某一基因功能缺失的转基因动物的研究基因结构与功能的方法。将已引起人排异反应的猪细胞膜上的一种糖（α-1，3-半乳糖）用基因敲除方法培育基因敲除克隆猪，或将人的基因导入其受体用于器官移植。②微生物基因克隆主要培养优良菌株，用于发酵工程生产抗生素、干扰素、胰岛素、激素类、生长因子、粒细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、各种疫苗、单克隆抗体（生物导弹）等生物制品的开发与生产。

总之，基因克隆技术潜力巨大，将为医学上展示无比的贡献。

3.试述SANGER DNA测序技术的原理及其在医学临床与科研中的应用。

（1）原理：利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

（2）应用：Sanger测序是目前所有基因检测方法（包括荧光定量PCR中的Taqman探针法、普通PCR法、基因芯片法、二代测序法等）的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，通常需要有Sanger测序验证数据予以支持。

1、应用于医学测序、健康管理和基因潜力开发的精准检测 Sanger测序已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。比如对BRCA基因或APC基因的检测分析，可用于早期发现乳腺癌或结肠癌的易感人群，从而对这些人群采取必要的干预措施。Sanger 测序还可以对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测，例如在非小细胞肺癌的治疗中，靶向药吉非替尼/厄洛替尼用药前必须要检测EGFR基因的状态，可以针对EGFR基因突变热点所在的第18，19，20，21外显子设计特异性扩增和测序引物进行直接测序。

2、为二代测序和芯片测序验证 Sanger 测序是 NGS 基因检测筛选单基因遗传病家系致病基因后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。值得注意的是，Sanger 测序目的是寻找与疾病有关的特定基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还是要依靠具有高通量测序能力的 NGS。

3. 亲子鉴定或法医鉴定这类技术是在Sanger测序技术基础上发展起来的一个技术，所用仪器与Sanger测序所用仪器一样，检测原理也一样。亲子鉴定可以通过对DNA遗传片段的检测，判定父母与子女之间的亲缘关系，而法医鉴定可以通过DNA测序提供死者或者嫌疑人的遗传信息。

4. 试述Western Blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。

（1）原理：Western Blot，即蛋白质印迹，又称免疫印迹。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质样品进行着色，再通过分析着色的位置和深度获得目的蛋白在样品中的表达情况信息。

具体而言，该技术通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并将其转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜、聚偏二氟乙烯膜等）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。

（2）方法：Western blot的主要流程如下，样品制备>>总蛋白质的定量>>SDS-PAGE电泳>>转膜>>封闭>>一抗孵育、二抗孵育>>加底物，显色/显影，定影/化学发光。

1）样品制备

通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白

［操作］

水溶液提取法

针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。

细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain有机溶剂提取法

对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

2）总蛋白质的定量

提取样品的总蛋白后需要对提取的蛋白作定量分析，以便于电泳时上样量的把握。目前蛋白定量主要有Lowry法、BCA法、沉淀法、Bradford法等，任何定量都需要选一个标准蛋白作为定量依据，绘制标准曲线，常用的且方便可靠的就是BSA（牛血清蛋白）。

3）SDS-PAGE电泳

包括制样、制胶和电泳等步骤。

聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(APS)，N，N，N，N- 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，具有分子筛效应。它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）,没有加变性剂如SDS，电泳过程中蛋白质保持完整的天然状态，蛋白在其中依三种因素进行分离：蛋白大小，结构和电荷；另外一种是变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）,在样品和凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白的二、三级结构被破坏，加入的SDS与蛋白结合后使得蛋白带有很强的负电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，最终蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小和凝胶分子孔径排阻效应。

4）转膜

将凝胶分离的蛋白从凝胶转移到膜上，目前方法有很多，比如溶移印相法、毛细管转移法、热对流转移法、真空印迹转移法、电转移法等，电转移法由于其快速性及高效性一直备受科研工作者的青睐。电转移法转膜有可分为湿转和半干转。WB实验中常用的膜有PVDF 和NC膜，PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固；PVDF膜使用是需要甲醇预处理的，用目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。而NC膜的使用也很简便，不需要预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了。不过NC膜比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途；而PVDF膜具有较高的机械强度，是印迹法中的理想固相支持物材料。

［操作］

半干法（用恒流）：将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转1h 或过夜。

5）封闭

从凝胶上转印的蛋白不能把膜表面全部占据，因此需要封闭膜上剩余的位点防止抗体非特异性吸附，这就是封闭。最常用的封闭物质是一些非相关蛋白，常见的有BSA、脱脂奶粉、各种动物血清、酪蛋白；封闭缓冲液的对后续蛋白检测的灵敏度、背景、信号强弱都有很大的影响。

［操作］

5％脱脂奶粉封闭1h，置于摇床上。封闭前，要用双蒸水洗3-5min,

6）抗体孵育

WB主要是由一抗特异性识别膜上的目的蛋白或抗原决定簇，一抗的选择主要依据于待检抗原。二抗的选择主要有三个原则：①效价高；高效价的二抗对WB的结果很重要；效价高的二抗在使用时由于稀释倍数高，自然非特异性吸附就低得多，背景也就低了。二抗效价高不但是二抗效价高，同时HRP标记的效率也要高。②背景低，抗体的纯度一定要高，高纯度的抗体产生的非特异性背景较少。；③质量稳定，质量稳定是比较难以把握但是又必须保证的，这就需要在制备抗体抗体过程中所有操作都是可重复的，每一步都有严格的质控。

［操作］

a把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（抗体浓度过高会导致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性 ）。室温不少于7小时，4 ℃时过夜。（一般）

b回收一抗溶液，用TBST洗膜3次，每次5min（洗涤不充分会导致膜上非特异性条带处仍有一抗残留，会影响二抗结合的位置不准确 ）。

c加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 室温避光1.5-2h

d回收二抗，TBST洗膜3次，每次5min，纯净水洗膜5min。

e短时间多次洗膜较长时间少次洗膜更有效。

7）显色

目前在WB检测中最常用的酶是AP和HRP，鉴于HRP的物美价廉，高性能的卓越表现，使AP渐渐退出历史舞台。AP对应的底物为BCIP/NBT。HRP对应的底物很多，DAB、TMB、ECL 等。

［操作］

ECL发光法：

辣根过氧化物酶HRP标记二抗，用底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用X胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。

（3）注意事项：

1）蛋白样品的制备

a细胞数量达5×106个时就可以做WB。

b将细胞裂解液再离心，收集上清液。

c测蛋白浓度（Bca法）,统一上样量。

d加loading BUFFER 煮样5min-10min。

e煮沸5-15min，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。有的也可以在700C加热5-10min，尤其适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状态则会影响标本进入凝胶的效率。）

2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

制胶：①一定要带手套，因为其中的丙烯酰胺为神经性致毒剂，对神经系统有损伤作用；

②加入各成分后一定要混匀，否则可能会有局部凝固的现象；③操作一定要快，防止提前凝固。

上样：①点样前需离心，取上清点样；②所有孔都点样，所点样品体积和量都差不多，重要样品点中间一点，最两边不要点重要样品；③为了便于标识分子量，WB建议使用彩色预染Marker。

3）转膜

a泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min（1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。

2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

b转膜顺序：阴极碳板(黑)+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板（白）

c转膜条件：0.4A 250V 1h-90min 冰浴中进行转膜（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）

d避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

e夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。

4）显色

发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底，影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。

（4）在医学科研中的应用：蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于基础医学与临床医学领域，进行蛋白质相关研究，包括目的蛋白的表达特性分析；目的蛋白与其他蛋白的相互作用；目的蛋白的组织定位；目的蛋白的半定量分析。如Western blot法诊断囊虫病；应用荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平；Western blot法测定风疹病毒特异性抗原；免疫印迹法、酶联免疫法及放射免疫法对胰岛自身抗体检测的比较；检测小分子蛋白的实验条件优化研究；间接免疫荧光法检测抗核抗体与免疫印迹法检测抗核抗体谱结果的分析；比较HIV抗体不确定血清蛋白免疫印迹法检测条件的正交实验优化及应用等。

5.结合专业，试述分子生物学在临床与科研的应用。

分子生物学技术在肿瘤诊断、预后和治疗中的应用已取得了一定的进展，主要反映在基因过量表达的检测、基因突变的检测、肿瘤微卫星不稳定性分析、肿瘤的易感性预测、病因检测、早期诊断、肿瘤疗效的监测及预后判断等八方面。

（1）基因过量表达的检测

无论是癌基因或抑癌基因，其蛋白制裁产物的过量表达可以用相应的抗体应用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中的蛋白质产物，也可应用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbrnt assay,ELISA）和免疫印迹（western blot）方法检测肿瘤细胞或血清中的蛋白质产物。随着生物学研究的进展，发现在越来越多的蛋白质，包括各种癌基因和抑癌基因产物、细胞因子、受体乃生长因子等在细胞调控中担负重要功能。不少蛋白质已被纯化，大量的单、多克隆抗体被制备，目前几乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有其相应的抗体问世，其中大多数抗体及试剂盒已商品化，为这些蛋白质产物的测定提代供了十分有利的条件。免疫组化可在组织切片上进行，其特点是在保持组织结构的条件下原位进行分析，特异性和敏感性都较强。ELISA是在细胞悬液中进行，可对特定蛋白质进行定量人析。Westrn blot既或对组织细胞进行分析，也可对释放至血液中的蛋白质进行检测，其敏感性和特性均较强。

新一代测定蛋白质产物的方法为流式经胞仪（folw Cytometry）测试法，道先标记荧光于相应的抗体蛋白制裁，标记有荧光的抗体蛋白质与特异抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对含有不同荧光信号的细胞进行分类、测试。该方法适膈对细胞群体进行分析。更新一代的影响细胞测试示（image cytometry）则可应用特定的波长的光密度进行积分，从而得到特定蛋白质的含量。

基因扩增的检测

肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，还可表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，这两种变化都可通过分子诊断的方法进行检测，经典方尖为核酸分子杂交，包括原位杂交（in situ hybridizsation,ISH）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、Southern blot(DNA杂交)、Northern blot(RNA杂交)、原位PCR 和RT-PCR等。

（2）基因突变的检测

癌基因和抑癌基因突变在肿瘤发生中出现的频率较高，突变的结果使癌基激活或抑癌基因失活，导政协委员细胞表型发生变化和肿瘤发生。基因突变是复杂的过程，不仅在肿瘤细胞中检测到突变的基因，对于某些癌前病变或癌前状态的组织细胞中也存在不同形式和不同程度的基因突变，在同一种肿瘤的不同发展阶段可能会涉及多咱基因的不同突为，在同一种肿瘤的不同发展阶段可能会涉及多种基因的不同形式的突变，充分说明肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤的复杂的生物程。

基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex

analysis,HA）。

1）PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。

2）异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。

3）突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 4）变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。

5）化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM为在Maxam-Gilbert 测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。

6）等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO 为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交

7）DNA芯片技术（DNA chip） DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。

8）连接酶链反应（ligase chain reaction,LCR） 与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree于1988年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。

9）等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于对已知突变基因进行检测。

10）RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。

11）染色体原位杂交（In situ hybridization of chromosome）染色体发现距今已有150多年的历史，染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究，随着染色体分技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大，特别是用于肿瘤分子诊断。

12）荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridiaation,FISH）创建于1986年。1969年Gall和Pardue首先应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百个碱基的单拷贝靶核苷酸序列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。

13）Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术（oligonucleotide primed in situ DNA synthesis,PRINS）,并成功地用于染色体特异α卫星DNA标记。其基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交，在DNA聚合酶作用下，当引物延伸时，掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点。DNA序列分析（DNA sequencing） 应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。

（3）肿瘤的微卫星不稳定性分析

微卫星不稳定性

微卫星不稳定性（microsatellite instability,MI）检测是基于VNTR的发现，细胞内基因组含有大量的碱基重复序列，一般将6-7bp的串联重称为小卫星DNA（minisatellite DNA）,又称为VNTR。而将1-4bp的串联重复称为微卫星DNA，又称简单重复序列（simple repeat sequence,SRS）。SRS是一种最常见的重复序列之一，具有丰富的多态性、高度杂合性、重组纺低等优点。

MI分析比RFLP及其他Southern杂交方法简易快速，基本方法为首先用PCR技术扩增所需的双核酸重复序列，然后在DNA序列分析凝胶电泳。MI分析是与PCR技术联系在一起的，由此也衍生出不同的方法和引物标记物，如用核素标记，电泳后的凝胶干燥后放射自显影

观察。近年来还引入了片动化分析系统，可用荧光素取代核素。分析时条带长度的确定可用已知长度梯度标准带分为参照，也可以用频度最高的带（优势带）为基准。由于MI可对单个细胞时行检测，并可对石蜡包埋的组织进行回顾性研究，结合显微解剖（microdissection）技术，可以使检测的目的更明确。

（4）肿瘤易感性检测

目前研究发现，有一部分恶性肿瘤的发生具有遗传学基础，故肿瘤遗传易感性的检测对于肿瘤高危人群的筛检及确定具有较大的实用价值。已知的肿瘤易感性基因有

Rb1,WT1,p53、APC、hMSH2,hMLH1和BRCA1等。研究者利用PCR-RFLP方法检测FAP家系的APC基因1309-1311位点的点突变，发现一个家系中有2个成员有点突变发生，经纤维镜检查证实2例均属于FAP患者。

（5）肿瘤相关病毒

业已证明一部分肿瘤的发生和病毒感染有关，因而检测这些相关病毒不仅可探计肿瘤和病毒的关系，而且可以找出肿瘤的易患人群。由于病毒太小，且难以培养，一般方法检测病毒效果极差。而核酸杂交技术与PCR技术用于病毒检测具有特异性强、敏感性高等特点。分子生物学技术能用于研究人乳头状瘤病毒（HPV）各亚型与良、恶性子宫颈病变的关系，且发现在子宫颈湿疣中存在HPV6、11亚型，在宫颈上皮内新生物和癌中，则存在16、18亚型，且HPV16、18亚型在胞质中位于中间丝和液泡间，核中位于附加体、液泡和染色质中。但在正常子宫颈组织和已治愈的宫颈新生上皮内且病变无复发的患者中，也有人发现HPV亚型（包括16亚型）。这些结果提示HPV与子宫颈新生物间存在复杂的关系，包括年龄因素、细胞内自身失控等。另外，报道在肿瘤性子宫颈细胞内查出了单纯疱疹病毒（HSV）特异性mRNA及巨细胞病毒（CMV）DNA,宫颈恶性病变与HSV及CMV有关。除HPV 外，其他病毒与肿瘤之间的关系通过研究也得到进一步证实。利用分子生物学技术检测肝癌细胞内整合型乙型肝炎病毒（HBV）及游离型HBV DNA,在原发性肝癌中其整合率可达90％，这对进一步说明HBV与原发性肝癌发生的关系具有重要意义。另外在霍奇金病和鼻咽癌的发生有密切关系。而在非霍奇金淋巴瘤（NHL）细胞中也曾检测到了HSV6型。有报道在人葡萄胎中发现了微小病毒，为研究葡萄胎的发生与微小病毒的关系提供了依据。利用原位杂交技术，可检测到白血病患者经过骨髓移植治疗后死亡的尸检组纪念品中的CMV DNA及卡波氏肉瘤组织内的CMV DNA。研究初步证实，ATL病毒可引起成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL/ATLL）。

（6）肿瘤的早期诊断和筛检

目前尚示找到对肿瘤早期诊断及早期治疗均具有重要意义的生化指标，AFP对肝癌患者的有一定的应用价值，用原位杂交技术在肝癌细胞和癌旁细胞中均发现了AFPmRNA，在癌组织中AFPmRNA阳性细胞分布均一，而在癌旁组织则中则呈散在分布。另外发现HBV DNA 与AFPmRNA可同时出现于肝硬变组织肝细胞内，提示HBV感染与AFP基因活跃表达有关，亦为研究HBV、AFP、肝硬变与肝癌的关系提供了科学依据。利用PCR-RFLP、PCR-XXCP等方法检测ras基因突变也有一定的意义，K-ras基因突变是一种在胰腺癌、结肠癌和肺癌中发现率较高的分子病变，且其突变点固定在12、13及61位密码子，并以12位密码子突变最为常见。对胰腺癌针吸活检组织作K-ras12位密码子突变检测，发现检出率为100％（12/12），而6例慢性胰腺炎患者均无突变发生。对大肠癌患者粪便中的ras基因突变检测，发现检出率与大肠肿瘤中ras基因突变检出率相似，达到33.3％，占ras基因突变大肠癌的88.9％，对临床检测和大肠癌高危人群的筛检测有意义。最近的研究报道表明，检测肠镜检查前肠道清洗粪液的DNA K-ras突变，可用于大肠癌高危人群的筛检，其检出率

达10％（7/39），其中1例患者在检出K-ras突变并随访4年后发现了大肠癌。目前发现有30％的骨髓（异型增生）综合征（MDS）有ras基因点突变，有ras基因突变的MDS转化为白血病的风险高，此外，ras基因突变可作为检测化疗及微小残瘤病的克隆性标记。

（7）肿瘤疗效监测

分子生物学技术对判断白血病的疗效及微小病灶的发现要作用，一般白血病临床治疗缓解期内的白血病细胞仍可达109个，用常规的细胞遗传学或FCM方法对白血病细胞的检出率为1％-5％，用核酸杂交技术可使检测灵敏度达0.15％-0.05％，而使用PCR方法则可检测出细胞总数1/105-1/107的残留白血病细胞，通常机体的免疫力只能杀量的肿瘤细胞，一旦肿瘤负荷达到一定程度即不易治愈，故白血病微小病灶的早期发现对预后特别重要，有助于及时采取适当的治疗措施及方案。另外在肿瘤治疗过程中，肿瘤细胞接触抗肿瘤药物后及方案。另外在肿瘤治疗过程中，肿瘤细胞接触抗肿瘤药物后会产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR）,MDR细胞中有种特异mRNA，转录这种mRNA的基因为mdr 基因，细胞中这种mdr基因转录的mRNA越多，细胞的耐药性就越强。mdr的mRNA含量低的白血病患者容达到缓解，并且可以较长时间维持完全缓解，若化疗过程中mdr mRNA逐渐升高，化疗反应会逐渐不敏感，因此用RP-PCR法检测mdr基因对疗效判断有帮助。分子生物学技术在肿瘤基因治疗也起重要作用，如用PCR技术监测导入的外源基因在体内的分布、存活及表达状况。

（8）肿瘤的预后判断

基因的突变与扩增与患者预后有关，Her-2/neu扩增与乳腺癌的预后相关；N-myc扩增与神经母细胞瘤的预后相关；抑癌基因p53突变与乳腺癌、肝癌、大肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的预的有关；RB与视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌及膀胱癌等肿瘤的预后有关。目前有关肿瘤分子病理分期的研究已取得了不少进展，对ras、c-myc、p53等基因突变与大肠肿瘤、卵巢癌等的临床分期和预后的关系进行了广的探讨，一致认为，临床分期为Ⅲ、Ⅳ期者ras、c-myc、p53表达率较高，预后较差。对卵巢粒层细胞瘤的癌基因检测发现，c-erb-2的过度表达或与c-ras、c-myc同时表达，患者预后较差。卵巢癌组织中nm23阳性者，患者预后差。目关提出用分部等位基因缺失（fractional alleilic loss,FAL）来判断肿瘤的良、恶性及预后，发现具有较高的准确性。

总之，分子物学技术在肿瘤易感性检测、早期诊断、判断预后、疗效监测等方面的研究已取得了一些进展，随着分子生物学技术研究的进展，其中肿瘤诊断方面也会像在传染病诊断中一样，显示较大的优越性，肿瘤早期诊断的难题一旦得到解决，会为及时治疗肿瘤，攻克癌症带来新的希望。

6. 试述你认为最重要的医学课题，并阐述理由。

肿瘤的靶向治疗。根据国家癌症中心2017年发布的数据，不论城市还是农村，肿瘤都是中国居民的主要死亡原因之一。我国的肿瘤防治现状仍不容乐观，肿瘤发病机制复杂、高危因素难控制等原因导致我国肿瘤预防难；有效筛查技术少、早期诊断技术水平低等因素导致肿瘤发现时普遍偏晚；肿瘤治疗效果差、复发转移率高且肿瘤治疗副作用大、精准性差等原因导致肿瘤治疗难度大；我国肿瘤自主规范少、基层医院诊疗水平参差不齐、诊疗均质化程度低。以上原因均导致肿瘤发病率和死亡率始终居高不下。

肿瘤是一个多因素导致的疾病，必须从多方面考虑其治疗机制。医学及其相关领域的不断发展，尤其是分子生物学技术，使人们对肿瘤的发病机制有了进一步的认识，专门针对肿瘤的治疗方法也由此而生，即靶向治疗。靶向治疗是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点（此位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段），来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。

肿瘤靶向治疗实际属于病理生理治疗，这种治疗手段主要是利用特殊的药物来靶向肿瘤发展过程中的关键受体，以此达到纠正其病理过程的目的。近年来针对肿瘤细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的新型治疗方案已逐步从实验室走向临床，具有十分广泛的应用领域，相对于手术、放疗和化疗三大传统治疗手段具有更彻底的治本功效。

1 靶向治疗的作用靶点及机制

1.1 具有靶向性的酪氨酸激酶抑制剂

1.1.1 靶向血小板衍生生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 血小板衍生生长因子

伊马替尼

舒尼替尼

索拉菲尼

1.1.2 靶向表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂 表皮生长因子受体

吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）

1.2 针对某些特定细胞标志物的单克隆抗体

达利珠单抗、易普利姆玛、贝伐单抗、EM164、Dalotuzumab（MK-0646）

1.3 针对某些原癌基因和抑癌基因的治疗

1.4 磁性药物载体的靶向治疗

2 存在的问题及展望

肿瘤靶向治疗在短短几年内得到迅速发展，但从临床角度看，靶向治疗目前刚刚开始应用，还处于入门阶段。尽管它很有潜力，但并不能代替手术、化疗和放疗等传统的肿瘤治疗方法。虽然肿瘤靶向治疗已经取得了一定的突破，但仍面临许多问题。以单抗为例，尽管单抗药物在体内具有较好的靶向性，能与肿瘤细胞特异性结合，并显示出选择性杀伤作用，而且比相应的游离药物具有更高的疗效或显示较低的毒性，但是其临床应用结果却不理想。为解决单抗靶向药物应用中的问题和障碍，今后应在抗体的人源化、双特异性抗体、寻找新的分子靶点、偶联物分子的小型化、单抗药物的高效化等方面进行集中研究。又如磁性药物，尽管其靶向治疗肿瘤的安全性和有效性较好，但若要广泛应用于临床，也有很多问题尚需解决，比如能否通过改善载体的表面性质以增强其主动靶向性；怎样提高载体的携药率及安全性问题；进一步研究针对不同部位、组织或器官的最佳粒子大小和磁场强度，以及由于肿瘤靶区位置不同而引起的载体分布情况和药物控释的问题；如何降低载体的生产成本，简化生产步骤，为磁性药物的大规模临床应用做准备。

随着现代生物医学技术的发展，肿瘤靶向治疗的研究取得了多项突破，面临的问题也正逐步解决。靶向治疗药物发展迅速，尤其在纳米技术和纳米材料的推动之下更显示出光明的发展前景。相信在可以预见的未来，对肿瘤细胞与组织的靶向治疗，对肿瘤患者的个性化治疗及对肿瘤干细胞的全面深入了解，一定能为攻克肿瘤难题起到积极的作用。