液体培养基中微生物的分离培养技术(精)
微生物培养方法
微生物培养方法微生物培养是一种用于研究微生物生理生化特性、生长繁殖规律及其与环境条件的关系等的重要技术手段。
以下是一些常见的微生物培养方法：1、固体培养基培养法固体培养基是在培养液中加入凝固剂，使培养基成为凝固状态的培养基。
这种培养基具有良好的稳定性，可以防止培养液中的微生物在培养过程中流失，同时也可以使微生物在固体表面生长繁殖，方便观察和检测。
固体培养基一般用于细菌、放线菌、酵母菌等微生物的培养。
2、液体培养基培养法液体培养基是一种不添加凝固剂的培养基，使培养基呈液体状态。
液体培养基中，微生物在培养液中自由悬浮生长繁殖，可以充分接触培养液中的营养物质，有利于微生物的生长繁殖。
液体培养基一般用于工业生产中的微生物培养，如发酵工业中制备各种发酵产品。
3、半固体培养基培养法半固体培养基是在液体培养基中加入少量凝固剂，使培养基成为半凝固状态的培养基。
这种培养基可以固定培养液中的微生物，同时也可以使微生物在半固体表面生长繁殖。
半固体培养基一般用于观察微生物的运动和生长情况。
4、厌氧培养法有些微生物需要在无氧或低氧分压条件下生长繁殖，因此需要采用厌氧培养法。
厌氧培养法一般采用密闭容器或厌氧手套箱中进行，可以提供无氧或低氧环境。
在厌氧培养法中，需要使用专门的厌氧培养基和厌氧菌株，以保证微生物的生长繁殖。
5、富集培养法富集培养法是一种常用的分离高浓度微生物的方法。
该方法是通过在培养基中添加一些特殊成分，如高浓度营养物质、抑制剂等，以抑制其他微生物的生长繁殖，从而增加目标微生物的数量和浓度。
富集培养法一般用于从自然界或工业生产中分离特定种类的微生物。
微生物培养方法有很多种，每种方法都有其特定的适用范围和特点。
在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的培养方法，以达到最佳的培养效果。
还需要注意无菌操作、环境控制等方面的技术细节，以保证微生物生长繁殖的良好环境和条件。
微生物的分离培养方法微生物的分离培养是微生物研究中常用的技术之一，它能够将目标微生物从复杂的微生物群体中分离出来，并进行纯培养。
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
微生物的分离和纯培养无菌技术无菌技术
连续培养：在微生物培养的过程中，不 断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌 体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物 长时间地处于对数生长期，以利于微生物 的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲 线中稳定期到来原因的认识，采取相应有 效措施推迟其来临，从而发展出现在的连 续培养技术。
连续培养原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对 数期后期时，一方面以一定的速度流进新 鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流 出培养液，使培养物达到动态平衡，其中 的微生物就能长期保持对数期的平衡生长 状态和稳定的生长速率。
连续培养和单批培养的比较
连续流入 新鲜培养液 单批培养 恒浊法
lg细胞数（个/ml）
4、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括 营养、生理、生长条件等，采用选择培养 的方法进行分离。 利用选择培养基进行直接分离 富集培养
三、微生物的培养
1、好氧培养和厌氧培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室 的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业 生产时用自然对流和机械通风法来供氧； 液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧； 液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的 目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气 达到供氧的目的。
微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
无菌技术：是将微生物分离、转接及培 养时防止被其它微生物污染的技术。 1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高 温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微 生物)。
3、无菌的环境 （1）在操作过程中的无菌要求：接种、 分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操 作）。 （2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中 进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙 醇等进行预处理及其他的必要措施。 （3）如进行好氧培养需对空气进行处理， 实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空 气，工业中使用空气过滤器过滤空气。
食品微生物检验技术模拟考试题(附参考答案)
食品微生物检验技术模拟考试题（附参考答案）一、单选题（共40题，每题1分，共40分）1、剪刀、镊子、接种针，使用前后都应当采用（）方式灭菌A、酒精浸泡B、烘箱消毒C、高压蒸汽D、酒精灯火焰灼烧正确答案：D2、处于（）期的细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用十分敏感A、延缓期B、衰亡期C、对数生长期D、稳定期正确答案：C3、以下最不适合用高压蒸汽灭菌的是A、试管B、营养琼脂培养基C、接种环D、血清正确答案：D4、以下属于鉴别培养基的是（）A、察氏培养基B、营养琼脂C、伊红美兰琼脂培养基D、麦芽汁培养基正确答案：C5、细菌性食物中毒中（）菌主要引起神经症状A、肉毒杆菌B、葡萄球菌C、福氏志贺氏菌D、副溶血弧菌正确答案：A6、某食品检出一培养物，其系列化生化试验结果为H2S－，靛基质－，尿素－，KCN－，赖氨酸＋，需进一步作（）试验A、ONPGB、甘露醇C、山梨醇D、血清学正确答案：A7、革兰氏染色的关键操作步骤是（）A、复染B、结晶紫染色C、酒精脱色D、碘液固定正确答案：C8、微生物生长所需要的生长因子是A、微量元素B、氨基酸和碱基C、维生素D、B.C二者正确答案：A9、载玻片和盖玻片在清洗前可先在（）溶液中浸泡1hA、8%的盐酸B、2%的盐酸C、2%的NaOHD、8%的NaOH正确答案：B10、以下靠电离作用杀菌的是A、红外线B、微波C、紫外线D、X射线正确答案：D11、一般不适用于熏蒸空气消毒的是（）A、甲醛B、醋酸C、乙醇正确答案：C12、玻璃器皿采用干热法灭菌时下面做法不正确的是A、在140－160℃温度下保温2－3hB、灭菌器皿放在恒温箱中排列整齐密实C、开通电源和箱顶通气口，至100℃时关上通气口D、切断电源冷却至60℃时取出灭菌物品正确答案：B13、使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌时，下面操作不正确的是A、器具与乳糖发酵管分开灭菌B、灭菌结束，待自然降到室温后开盖C、密闭容器，打开电源开关，加热至温度为121℃D、放入的物品应留有蒸汽流通的空间正确答案：C14、细菌生长繁殖中需营养物质其中的铵盐、硝酸盐、蛋白胨等属于哪一类物质（）A、碳源B、维生素类C、无机盐类D、氮源正确答案：D15、以下是革兰氏阳性菌G＋的是（）A、大肠杆菌B、枯草芽胞杆菌C、金黄色葡萄球菌D、B、C都是正确答案：D16、微生物的纯培养可用A、平板倾注法B、平板划线法C、单个细胞技术D、所有这些方法正确答案：D17、人们常用菌类含量来检测水质污染的程度，这种菌类是（）B、根瘤菌C、乳酸菌D、大肠杆菌正确答案：D18、糖(醇)类发酵试验结果观察和记录正确的是A、不产酸产气，阳性，以“+”表示B、产酸不产气，阴性，以“-”表示C、产酸不产气，阳性，以“+”表示D、不产酸产气，阴性，以“+”表示正确答案：B19、下列不属于细菌特殊结构的是（）A、鞭毛B、核质C、荚膜D、芽孢正确答案：B20、某饮料作金黄色葡萄球菌检验，经胰酪胨大豆肉汤增菌后，应转种（）平板A、2%琼脂B、血C、伊红美兰D、SS正确答案：B21、下列何种微生物培养时会产生溶血环现象A、肺炎支原体B、乙型溶血性链球菌C、肺炎链球菌D、军团菌正确答案：B22、嗜热菌是造成以下哪类食品腐败变质的主要因素（）A、罐头食品B、冷冻食品C、酒类D、水产品正确答案：A23、下列标准不属于技术标准的是( )A、环境质量标准B、基础标准C、技术管理标准D、产品标准正确答案：C24、使用油镜时在物镜和标本片之间滴加香柏油的目的是A、增加入射波波长B、增大数值口径（NA）C、增加显微镜放大倍数D、使视野更明亮正确答案：B25、细菌对糖的分解，是将多糖分解成丙酮酸，厌氧菌将丙酮酸进一步分解成各种有机酸，H2和CO2，此过程称为A、三羧酸循环B、氧化C、发酵D、还原正确答案：C26、平板划线接种的目的是A、保藏菌种B、分离出单个菌落C、传代D、鉴别菌种正确答案：B27、对于靛基质试验，下列说法正确的是A、培养基中不用含有丰富的色氨酸B、培养基中要含有丰富的色氨酸C、加试剂后呈现玫瑰红色，为阴性反应D、培养基的PH值应为7.0～7.2正确答案：A28、常用于酵母菌生长的培养基的为（）A、肉汁培养基B、麦芽汁培养基C、高氏培养基D、察氏培养基正确答案：B29、无菌采样时操作人员手和容器消毒后，下面操作不正确的是A、液体样品瓶口消毒后开盖直接倒入取样瓶中B、固体样品用灭菌勺取样装入容器C、在酒精灯火焰下封口D、采样容器在火焰下消毒瓶口加盖封口正确答案：A30、细菌细胞壁主要成分是（）A、纤维素B、肽聚糖C、几丁质D、果胶糖正确答案：B31、志贺氏菌属包括福氏志贺氏菌等（）个群A、4B、5C、8D、6正确答案：A32、以下不常用于化验室、医院、公共场所的消毒剂为A、来苏尔B、甲醛C、紫外线D、生石灰正确答案：B33、在菌落总数的检验中，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过多少分钟A、25minB、15minC、30minD、20min正确答案：D34、下列哪种细菌能使赖氨酸脱羧（）A、变形杆菌B、甲型副伤寒沙门氏菌C、阴性杆菌D、沙门氏菌正确答案：D35、下列描述不正确的是A、由于低温对微生物生长有抑制作用，故广泛用于保藏食品和菌种。
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
微生物的分离技术—微生物菌落分离技术
（anerobe） anaerobe)
专性厌氧菌 只能在无氧条件下生长，有氧时即被杀死
(anaerobe) （拟杆菌，梭菌属，双歧杆菌属，甲烷菌）
2.厌氧菌的氧毒害机制
O2 + e-
O2 -. （超氧阴离子自由基）
O2-. + e- + H+
H2O2 （过氧化氢）
H2O2 + e- + H+
H2O + OH·（羟基自由基）
某些能生活在大洋底部的微生物不能在常压下生 长，这种菌叫做嗜压菌。人工培养只能在高压的特殊 容器里进行。
在食品发酵工业中，随着发酵设备的大型化，处 于发酵设备底部的微生物的生长代谢，也会受到液体 静压力的影响，曾有工厂发现200m3发酵罐（高18m） 底部的酵母在酒精发酵中形态发生了变化。
八、声能
冷藏温度：指在0～5℃之间的温度。一些嗜冷微生物 尚能缓慢生长，能阻止几乎所有的引起食物中毒的病原菌 生长（除肉毒杆菌E型尚能在3.3℃生长和产生毒素外）。 冷藏温度可用于储存果蔬、鱼肉、禽蛋、乳类等食品。
冻藏温度：指低于0℃以下的温度。在–18℃以下的温 度几乎阻止所有微生物的生长。
3. 高温对微生物的影响
微生物在高温环境下为何能生存呢？
胞内酶和蛋白质在高温时更稳定（分子中1个或多个部位被某些氨 基酸所取代，能以特殊的方式折叠，抵抗温度的变性作用）;
细胞质膜富含饱和脂肪酸，因而膜在高温下仍很稳定并发挥功能;
其核酸有热稳定性的结构，tRNA在特定的碱基区域含较多GC对.
2. 低温对微生物的影响
(1) 冰冻对微生物的影响
好氧菌 兼性厌氧菌
不需氧可生长，而在有氧条件下生长
（aerobe） （facultative aerobe）更好（酵母菌，许多细菌）
1.下列关于微生物的培养和分离的叙述中,不正确的是( )
1．下列关于微生物的培养和分离的叙述中，不正确的是()A．细菌能在液体培养基中以二分裂方式迅速扩增B．噬菌体或大肠杆菌可在蛋白胨培养基中增殖C．灭菌的目的是消灭与培养菌竞争的杂菌D．稀释涂布法分散细菌得到单菌落的效果更好解析：细菌繁殖方式是二分裂方式，噬菌体是没有细胞结构的病毒，需要在活细胞中才能生活，在蛋白胨培养基中不能增殖；灭菌目的是防止杂菌和培养菌发生竞争。
答案：B2．用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时()①可以用相同的培养基②都需要使用接种针进行接种③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌A．①②B．③④C．①③D．②④解析：平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基，故①正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，故②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故③正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故④错误。
答案：C3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是()A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上生长的菌落数目，因此，用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。
对照遵循的原则是单一变量原则，所以与选择培养基一样，应进行接种培养。
答案：C4．某实验小组欲从土壤中筛选出能分解淀粉的芽孢杆菌。
下列叙述不正确的是() A．采样与培养：称量1g土样置于刚配制的液体培养基中，30℃振荡培养B．接种：为避免培养液中菌体浓度过高，需经过系列稀释后接种C．选择：所用的固体培养基，作为唯一碳源的是淀粉D．筛选：将适量的碘液滴加到平板中的菌落周围，出现透明圈的说明此种菌能分解淀粉解析：为了确保分离出的目的菌是从土壤中分离的，所用培养液和仪器等都要严格灭菌，所以刚配制的培养基必须经高压蒸汽灭菌处理才能使用。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液