9 微生物的稀释分离技术.
微生物的分离和纯培养无菌技术无菌技术
连续培养：在微生物培养的过程中，不 断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌 体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物 长时间地处于对数生长期，以利于微生物 的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲 线中稳定期到来原因的认识，采取相应有 效措施推迟其来临，从而发展出现在的连 续培养技术。
连续培养原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对 数期后期时，一方面以一定的速度流进新 鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流 出培养液，使培养物达到动态平衡，其中 的微生物就能长期保持对数期的平衡生长 状态和稳定的生长速率。
连续培养和单批培养的比较
连续流入 新鲜培养液 单批培养 恒浊法
lg细胞数（个/ml）
4、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括 营养、生理、生长条件等，采用选择培养 的方法进行分离。 利用选择培养基进行直接分离 富集培养
三、微生物的培养
1、好氧培养和厌氧培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室 的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业 生产时用自然对流和机械通风法来供氧； 液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧； 液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的 目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气 达到供氧的目的。
微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
无菌技术：是将微生物分离、转接及培 养时防止被其它微生物污染的技术。 1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高 温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微 生物)。
3、无菌的环境 （1）在操作过程中的无菌要求：接种、 分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操 作）。 （2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中 进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙 醇等进行预处理及其他的必要措施。 （3）如进行好氧培养需对空气进行处理， 实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空 气，工业中使用空气过滤器过滤空气。
微生物分离纯化方法
微生物分离纯化方法微生物的分离纯化是微生物学研究中的一项重要工作，也是微生物学实验的基础。
微生物的分离纯化方法主要包括：传代分离、菌落接种法、涂布法、稀释法、摇瓶分离法等。
下面将详细介绍这些方法。
1. 传代分离传代分离法是指将微生物涂布于固体培养基上，通过连续传代的方式分离纯化目标微生物。
这种方法适用于真菌和细菌的分离纯化。
首先，选择适当的固体培养基，可以是含有特定培养物质的普通富养基或特定选择性培养基。
然后，将待分离的微生物悬浮液均匀涂布在固体培养基表面。
在培养过程中，单个微生物菌落会逐渐生长并形成纯化菌落。
最后，将纯化菌落挑取至新的培养基上进行进一步培养和鉴定。
2. 菌落接种法菌落接种法是指以微生物营养琼脂平板为基础，在平板表面单独培养微生物，通过菌落形态和特征来分离纯化目标微生物。
首先，将待分离的微生物悬浮液均匀涂布在营养琼脂平板表面。
在培养过程中，微生物会形成单个菌落，每个菌落代表着一个细胞或一组具有相同基因型的细胞。
通过观察和鉴定菌落形态、色素、质地等特征来筛选出目标微生物的纯化菌落。
3. 涂布法涂布法是指将待分离的微生物悬浮液均匀涂布于特定培养基固体表面，通过菌落形态和特征来分离纯化目标微生物。
这种方法适用于分离纯化微生物群落中的特定微生物。
首先，选择适当的富养基或选择性培养基，将待分离的微生物悬浮液均匀涂布于固体培养基表面。
在培养过程中，微生物会形成不同的菌落，其中包含目标微生物。
通过观察和鉴定菌落形态、色素、质地等特征来筛选出目标微生物的纯化菌落。
4. 稀释法稀释法是指将待分离的微生物悬浮液通过连续稀释的方式进行纯化。
首先，将待分离的微生物悬浮液进行适当稀释，然后取一定体积的稀释液均匀涂布在固体培养基表面。
在稀释过程中，微生物会逐渐被稀释至单个细胞的数量，从而使目标微生物单独生长并形成纯化菌落。
5. 摇瓶分离法摇瓶分离法是指将待分离的微生物悬浮液均匀地放置在摇瓶中，并通过不同时间和速度的连续摇动来分离纯化微生物。
微生物稀释 分离
微生物稀释分离微生物稀释分离是一种常用的实验方法，用于研究和分离微生物。
本文将从实验原理、实验步骤和应用三个方面介绍微生物稀释分离的相关知识。
一、实验原理微生物稀释分离是利用稀释液中的微生物数量与菌落数呈反比关系的原理进行的。
在一定条件下，将含有微生物的样品逐级稀释，然后将稀释液平铺在培养基上，使微生物落在培养基上并繁殖。
最终，通过观察菌落的形态、颜色和大小等特征，可以分离出不同的微生物种类。
二、实验步骤1. 准备培养基：选择适当的培养基，如营养琼脂培养基、选择性培养基等。
根据需要添加抗生素或其他抑制剂。
2. 样品处理：将待检样品进行预处理，如稀释、研磨、搅拌等，以获得均匀的微生物分布。
3. 稀释液的制备：取一系列不同浓度的试管，分别加入适量的稀释液。
通常采用10倍稀释法，即每次从前一级的稀释液中取出1mL加入到下一级的稀释液中。
4. 取样：将样品分别取出一定体积加入到各级稀释液中，充分混合后可得到一系列不同浓度的稀释液。
5. 平铺培养：将每个稀释液均匀平铺在培养基上，用铅笔标明每个培养皿的稀释倍数。
6. 培养：将平铺好的培养皿在适当的环境温度下进行培养，一般为37摄氏度。
根据不同的微生物种类和培养基的要求，培养时间可在24小时至数天之间。
7. 菌落观察：观察培养皿上的菌落形态、颜色、大小等特征，并记录下来。
通过菌落的特征，可以初步判断出不同的微生物种类。
三、应用微生物稀释分离广泛应用于微生物学研究和实验室诊断中。
具体应用如下：1. 分离纯种菌株：通过微生物稀释分离的方法，可以将混合菌群中的不同种类的微生物分离出来，得到纯种菌株，为后续的研究提供基础。
2. 药敏试验：微生物稀释分离可以用于药敏试验，即将不同抗生素加入到培养基中，观察菌落的生长情况，判断微生物对抗生素的敏感性和耐药性。
3. 食品安全检测：微生物稀释分离可以用于食品中微生物的检测和分离，判断食品是否受到污染，以保障食品安全。
4. 环境监测：微生物稀释分离可以用于环境中微生物的监测，如水源、土壤、空气等。
微生物的分离和纯化实验原理及步骤
实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。
单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
环境中微生物的检测和分离纯化实验报告
环境中微生物的检测和分离纯化一．实验原理1.微生物的分离与纯化土壤中含有丰富的微生物，可以从中分离纯化得到很多有价值的菌株。
微生物常用的分离方法是平板分离法，根据某种微生物对生长条件的不同要求供给它适宜的培养环境，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直到得到纯菌株。
2.平板菌落计数法将待测样品经适当稀释后，其中微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含的菌落数。
二．实验材料与试剂1.土壤稀释溶液2.取液器（1000ml 1支），培养箱，培养皿（12个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000ml无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。
三．实验步骤（一）.无菌平板制备1.采用叠皿法把牛肉冻蛋白膏培养基倒入灭好菌的培养皿中，制作无菌平板（二）.周围环境中微生物的检测2.取一平板，分成6个区，做好标记。
同一个人同一根手指头按如下要求用力一致进行操作：分别用未洗过的手指头，自来水打湿的手指头，自来水认真洗过的手指头，洗手液洗过一遍的手指头，洗过两遍的，洗手液洗过又用酒精棉球消毒后的手指头在六个区上涂抹。
（平板1）3.取一平板，分区，分别用使用过的纸巾，硬币，旧纸币，餐卡在不同区拖动。
（平板2）4.在培养基上方抖动头发数次。
（平板3）5.取一平板，分区，用无菌接种环分别蘸一滴自来水，河水，豆浆在不同区划线。
（平板4）6.用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。
（平板5）7.取两个平板，一个打开在实验台上放置30分钟，另一个在酒精灯火焰边打开皿盖1分钟。
（平板6）8.取一平板，打开盖，咳几下。
（平板7）（三）.从土壤中分离微生物1.采土样2.制备土壤稀溶液3.涂布吸取100ml稀释好的土壤稀溶液，较均匀地滴在平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，涂1—2分钟4.培养将培养基平板倒置于37℃下培养24小时5.菌落计数四．实验结果1.平板1：从未洗到用酒精消毒总体趋势是菌落数越来越少，用自来水洗过和用洗手液洗过一遍的菌落数差不多；平板2：旧纸币和硬币的菌落数要多；平板3：抖头发的地方附近长出许多菌落；平板4：自来水菌落最多，其次是河水，河水的菌落分布成“牛”字形，和当时划线的形状一样，再其次是豆浆；平板5：划线的地方长出许多菌落；平板6：放在试验台上的平板长出各种形状的菌斑菌块，在酒精灯旁的基本没有菌落；平板7：咳几下的基本没有菌落。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
微生物的分离纯化：平板分离法
微生物的分离纯化：平板分离法基本原理分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。
其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
包括稀释涂布平板法稀释混合平板法平板划线法土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地。
本实验采用三种不同的培养基和方法从土壤中分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。
操作步骤采样：选取校园内或校园附近地点，用无菌药匙，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样约30g，装入事先准备好的无菌瓶内并盖好。
编号并记录地点、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
制备土壤稀释液土壤稀释液的制备和稀释液的取样（建议稀释到10-即可）无菌操作1.取三只无菌培养皿，在皿底用记号笔写上稀释度、组别观察分离出的真菌菌落形态。
稀释混合平板法土壤稀释液的制备和稀释液的取样倒平板的无菌操作将融化的琼脂培养基,冷却至50℃左右(以手背能忍受的温度为准)，在酒精灯火焰旁，右手掌心握住三角瓶的底部，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，灼烧瓶口。
用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15 mL,铺满皿底），迅速盖好皿盖。
左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。
也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。
如何从土壤中分离出微生物
如何从土壤（污水）中分离出微生物把污水加蒸馏水分别稀释10，100，1000倍，然后加入培养基中培养，如果培养出来菌落重合，菌非常多，无法分离，就加大稀释倍数，直至获得清晰可分离的菌落，有时甚至是非常小的菌落，要用倒置显微镜操作。
而培养基则根据要分离的菌的营养类型进行配置，若要获得多种微生物就要配置多种培养基进行如上操作。
对于土壤加水溶解，对溶解液进行如上操作，不溶的部分就不用管了1.取以少许土壤（一地表以下10cm处为宜）与适量无菌水混匀备用2.做浸出液的梯度稀释3 .涂平板4.划线分离5.接平板，接斜面6.检测从土壤中分离微生物环境工程（1）班一、试验目的1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。
2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。
二、实验原理土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。
它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。
此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。
因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。
三、实验器材(—)培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）高氏一号琼脂培养基（培养放线菌）查氏培养基（培养霉菌）(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。
(三)土壤样品、天平、称旦纸。
（四）恒温箱、气体流量计四、试验程序1、倒平板将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；2、制备土壤稀释液准确称取土样10g，加入装有90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液3、涂布将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。
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菌落计数规则：
选择平均菌落数在30~300间的平板
1、只有一个稀释度符合，则以该稀释度
的平均菌落数乘以稀释倍数； 2、有两个稀释度符合，取决于二者比值 （高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌 落数的值）： 1）若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落 数乘稀释倍数所得的值的均值。 2）若2≤比值或比值≤ 0.5，则取其中较 少的菌落总数。
微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功
能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。
土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从
中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。
分离纯化：菌种被其他杂菌污染或混合菌悬 液常要进行分离纯化； 方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种。 要获得某种微生物的纯种，还需提供有利于 该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。 细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37℃ 温 度下培养1-2天。 平板菌落计数——活菌计数
微生物的稀释分离技术
实验目的、要求
（1）学习微生物的分离技术。 （2）学习从样品中分离、纯化出所 需菌株。 （3）学习平板菌落计数法。
以细菌为例
实验原理
纯种分离技术
分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯种的方 法。 纯种（纯培养）：一个菌落或一个培养物中所有的细 胞是由一个细菌（或细胞）分裂繁殖而产生的后代。
3、若所有稀释度的菌落平均数均大于 300，则按稀释倍数最高的平均菌落数 乘以稀释倍数； 4、若所有稀释度的菌落平均数均小于 30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘 以稀释倍数报告；
所有菌落数均不在30~300间 以最接近30或300的平均菌落数乘稀释 倍数
6、平板划线法
挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做
分区和划线。 370C培养48h检查菌落是否单纯。 无菌操作（ 近火焰处操作）： 划线方法： ：灼烧、冷却、取菌 区1划线 灼烧、冷却 区2划线 区3划线 灼烧、冷却 区4划线…… 完毕、灼 烧
结果与讨论
计算含菌样品中的所含活菌总数 在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？
实验内容
1、土样取样: 选择肥沃土壤,去表层土,挖3－8cm深度的土壤 数10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验 室。 2、制备土壤稀释液： 称取土样1.0g，放入盛99ml无菌水的三角瓶中， 置摇床振荡20min使土壤均匀分散成为土壤悬液 （10-2）。用100ul移液枪从中吸取100ul土壤悬液， 注入事先分装有900ul无菌水的离心管中，吹吸3次， 振荡均匀（10-3）。然后同样方法，配置成稀释度 为10-4，10-5的土壤菌悬液。
3、分离 稀释涂布平板法
用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各 浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀 地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板 上，用灼烧冷却后的无菌涂布器涂匀。每个浓 度做3个平板（重复）。
注意：无菌操作；用枪头吸取菌悬液时注意“吹打数 次”确保混匀。
4、培养
待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于 370C温箱中培养24h；
0.1
0.1ml 0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.1ml
0.9ml
0.9
0.1ml
0.1ml
0.1ml
分离纯化 基本流程
实验仪器、材料
实验材料 菌源:土样10g; 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基; 实验仪器与用具 1)超净工作台、恒温培养箱、酒精灯 2）1000ul及100ul移液枪、1000ul及100ul 枪头、无菌1.5ml的离心管、离心管架 3）无菌平皿、涂布器、接种环 实验试剂:无菌水;
5、菌落计数
含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一 个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可 见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出 每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成 数目）。 选择平均菌落数在30~300间的平板，求其平 均值。 每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形 成数（同一稀释度平板上菌落平均数× 10× 稀释倍数）/含菌样品克数