金黄色葡萄球菌肠毒素产量的优化工艺
环介导等温扩增技术
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采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
辣椒制品金黄色葡萄球菌污染及肠毒素污染研究
Ａ ｓｒｃ ： ｊｃｉｅＴｏｒａｉ ｅ ｏ ｔｍｉａｉ ｔａｉｎｏ ｔｐ ｙｏ ｏｃ ｓａ ｒｕ ｈｌｃｎ ｉ ｎ ， ｂ ｔ ｔＯｂｅｔ ． ｌ ｅ ｈ ｎａ ｎ ｔ ｎｓ ｕ ｔ ｆ ａ ｈ １ｃｃｕ ｕｅ ｓ ｎｃ ｉ ｏ ｄｍｅ ｔ ａ ｖ ｅ ｚｔ ｃ ｏ ｉ ｏ Ｓ ｉ ｉ
对 样 品进行金 黄 色葡 萄球 茵分 离、 培养 ， ＶＩ Ｋ ２ｃｍｐｃ 全 自动 微 生物 鉴定 分析 系统进 行 生化 鉴 用 ＴＥ ｏ ａｔ
定， 同时用 全 自动 荧光 酶标 免 疫 测 试 系统 （ Ｄ ０ 检 测 分 离菌株 携 带肠 毒 素 Ｓ Ａ＿Ｅ ＶＩ ＡＳ ３ ） Ｅ Ｓ Ｅ情 况。 结
中 图分类号 ： ２ ７ ４ ＴＳ ０ ． 文献 标识 码 ： Ｂ 文 章编号 ：Ｏ Ｏ ９ ３ ２ １ ） １ Ｏ ２ ４ １ ０ 一９ ７ （０ ２ ０ 一ｏ ６ —０
Ｃｏ ｔ ｍｉ ｔ ｎａ ａｙ ｉ ｏ ａ ｈ Ｉｃ ｏ ｕ ｕｅ ｓａ ｄ Ｓ ａ ｈ Ｉｃ ｃ ａ ｎａ ｎ ｉ ｎ ｌ ｓ ｆ ｐ ｙｏ ｃ ｃ ｓａ ｒｕ ｎ ｔｐ ｙｏ ｏ ｃ ｌ ａｏ ｓ Ｓ
ａ ｓ ｓ ｍ ｅ ｔ ｃ ｒ ｏ ａ ｅ ａ ｄ ｐ ｏ ｕ ｔｃ ｔｇ ｒ ｎ ｇ ｍｅ ｔ Ｍ ｅｈ ｄ ： ｅ ｍｅ ｈ ｄ ｓ ｄ ｖ ｌ ｐ ｄ ａ — ｓ ｅ ｓ ｎ ，ｏ ｐ ｒ ｔ ｎ ｒ ｄ ｃ ａ ｅ ｏ ｙ ｍａ ａ ｅ ｎ ． ｔ ｏ ｓ Ｔｈ ｔ ｏ ｓ ｗａ ｅ ｅｏ ｅ ｃ
ｃ ｒ ｉ ｇ ｔ ７ ９ １ — ２ １ ， ｔ ｈ ＴＥ ２ ｃ ｍ ｐ ｃ ｕ ｏ ｔ ｄ ｍ ｉｒ ｂ ａ ｄ ｎ ｉｉａ ｉ ｎ ｓ ｓ ｅ ｏ ｄ ｎ ｏ ＧＢ ４ ８ ． ０ ０ ０ ｗｉｈ ｔ ｅ ＶＩ Ｋ ｏ ａ ｔ ａ ｔ ｍａ ｅ ｃ ｏ ｉ ｌｉ ｅ ｔｆ ｔｏ ｙ ｔ ｍ ｃ ｆ ｒｂ ｏ ｈ ｍｉａ ｎ ｌ ｓｓ ｅ ｔ ｒ ｔ ｘ ｎ Ｅ Ｓ Ｅ ｓｔ ａ ｉ ｎ ｏ ｔａ ｎ ｔ ｔ ｍ ａ ｉ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｅ － ｏ ｉ ｃ ｅ ｃ ｌａ ａ ｙ ｉ ， ｎ ｅ ｏ ｏ ｉ ｓ Ｓ Ａ— Ｅ ｉｕ ｔｏ ｆｓ ｒ ｉ ｓ ｗｉ Ａｕ ｏ ｔ ｆｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｎ ｈ ｃ
金黄色葡萄球菌耐药性及肠毒素分型研究
金黄色葡萄球菌耐药性及肠毒素分型研究史红;张鹏;王娟;郑增忍;单虎;王述柏;李玉清;黄秀梅;刘开成;韩艳【摘要】为了解从生鲜乳中分离得到的31株金黄色葡萄球菌的耐药性和肠毒素分布情况,用微量内汤稀释法进行药敏试验,用PCR方法进行肠毒素的检测和分型.结果表明,31株金黄色葡萄球菌耐药率在50％以上的抗菌药有7种,药耐药率小于10％的有3种；敏感率大于50％的抗菌药有6种,敏感率小于10％的有5种.31株金黄色葡萄球菌毒素基因携带率为93.5％,同时携带2种及以上毒素的菌株占67.7％,有SEA基因的占38.7％,含其他传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占40.4％,携带新发现的毒素基因SEG、SHE、SEI和SEJ的菌株占67.7％.说明本次试验中的31株金黄色葡萄球菌对6类13种抗菌药都有不同程度的耐药性,且多重耐药现象比较严重.生鲜乳中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,且携带新发现的肠毒素基因较多.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)006【总页数】4页(P87-90)【关键词】金黄色葡萄球菌;耐药性;肠毒素【作者】史红;张鹏;王娟;郑增忍;单虎;王述柏;李玉清;黄秀梅;刘开成;韩艳【作者单位】青岛农业大学,山东青岛266109;青岛农业大学,山东青岛266109;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;青岛农业大学,山东青岛266109;青岛农业大学,山东青岛266109;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;青岛农业大学,山东青岛266109;青岛农业大学,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】S852.611奶牛乳房炎是世界范围内发生最普遍、防治最难的奶牛疾病之一。
奶牛乳房炎不仅引起奶牛产乳量的下降和乳品质的改变，严重时还会使奶牛泌乳机能完全丧失，造成巨大的经济损失，有时还会影响食用者的身体健康［1］。
实验十二金黄色葡萄球菌
致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。
精品课件
5
金葡菌镜下特征
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6
操作流程
检样25g(mL) +稀释液225mL，均质
7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）
36℃±1 ℃， 18h~24h
Baird-Parker平板，血平板
36℃±1 ℃
B-P平板18h~24h或45h~48h 血平板 18h~24h
涂片染色
观察溶血
BHI肉汤和营养琼脂斜面 血浆凝固酶试验
结果报告
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菌落特征
Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色， 周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径 2mm~3mm。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典 型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干 燥。
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取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中， 再加入 BHI培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇 匀，置 36 ±1 ℃温箱或水浴箱内，每半小时 观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管 倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原 体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆 凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培 养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明 书操作，进行血浆凝固酶试验。
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生化特性
典型的金葡菌呈球形，大小0.5×1.0μm。致病 性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长， 常呈双球菌或短链状排列。
本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰 氏染色阳性。
金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为 5%～7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制 杂菌。
两种金黄色葡萄球菌产肠毒素差异的Meta分析
文章编号: 1006-3617(2010)05-0301-04 中图分类号: R15 文献标志码: A【论著】两种金黄色葡萄球菌产肠毒素差异的Meta 分析骆璇1，郭红卫1*，李洁2摘要: ［目的］ 分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin -resistant Staphylococcus aureus ，MRSA ）和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus ，MSSA ）之间产生肠毒素的差异，为评价MRSA 、MSSA 与金黄色葡萄球菌食物中毒之间的关系提供参考依据。
［方法］ 采用 Meta 分析方法对国内外1990~2008年发表的有关MRSA 和MSSA 产毒株率比较的文献进行汇总、归纳和统计分析。
［结果］ 共检索到7篇文献，合并总RR 值为2.18，95%可信区间为1.58~2.99。
MRSA 中的产毒株率是MSSA 的2.18倍。
［结论］ MRSA 产生肠毒素的概率远大于MSSA 。
关键词: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌；肠毒素；Meta 分析Comparative Prevalence of the Enterotoxin-producing Isolates in Two Strains of SaphylococcusAureus Using Meta-analysis LUO Xuan 1, GUO Hong-wei 1*, LI Jie 2（1. Department of Nutrition and Food Hygiene ，School of Public Health ，Fudan University ，Shanghai 200032，China ；2. Shanghai Food and Drug Administation ，Shanghai 200233, China ）.*Address correspondence to GUO Hong-wei ; E-mail : hwguo@Abstract: ［Objective ］ To analysis the difference in enterotoxin production between methicillin -resistant Staphylococcus aureus （MRSA）and methicillin sensitive Staphylococcus aureus （MSSA）so as to provide a reference to evaluate their association with staphylococcus aureus food poisoning. ［Methods ］ Meta -analysis was used to evaluate the data extracted from published articles domestic and abroad relevant to comparative prevalence of the enterotoxin -producing isolates in MRSA and MSSA during 1992-2008. ［Results ］ A total of 7 articles were retrieved. The overall effect indicator RR （95%CI ）was 2.18（1.58-2.99）. The prevalence of the enterotoxin -producing isolates in MRSA was 2.18 fold greater than in MSSA. ［Conclusion ］ The probability of enterotoxin production in MRSA was far more than in MSSA.Key Words: Staphylococcus aureus; methicillin sensitive Staphylococcus aureus; MSSA; enterotoxin; Meta-analysis ［基金项目］上海市科委2007年度重大科技攻关项目（编号：07dz19508-6）［作者简介］骆璇（1984-），男，硕士生；研究方向：食品安全；E -mail：072102108@［*通信作者］郭红卫教授；E -mail：hwguo@［作者单位］1.复旦大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，上海200032；2.上海市食品药品监督所，上海 200233肠毒素是金黄色葡萄球菌引起食物中毒的主要致病因子。
百里香抑菌物质的提取工艺优化及活性研究
百里香抑菌物质的提取工艺优化及活性研究王娣;柯春林;曹珂珂;李妍【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2018(043)004【摘要】研究百里香中抑菌成分的超高压提取工艺及抑菌作用,考察压力、酒精浓度、料液比对百里香提取物抑菌作用大小的影响,采用响应面法优化百里香抑菌成分超高压提取的最佳条件;采用倍半稀释法测定百里香提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及单增李斯特菌的最小抑菌浓度(MIC);检测抑菌物质对细菌的生长曲线、核酸泄漏的影响;对百里香提取物成分进行分析.实验结果表明:在压力380 MPa、乙醇浓度83％、料液比1:42 (g/mL)的条件下,相对电导率为15.69％±0.21％;百里香提取物处理细菌后与对照组相比,菌生长缓慢,迟滞期延长,细胞膜通透性增加,核酸泄露量明显增加,说明百里香提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及单增李斯特菌生长具有一定抑制作用;每1 g百里香超高压提取物中含黄酮0.189 mg、多酚0.162 mg、多糖0.085 mg、百里香酚0.134 mg.【总页数】8页(P93-100)【作者】王娣;柯春林;曹珂珂;李妍【作者单位】蚌埠学院生物与食品工程系,安徽蚌埠233030;蚌埠学院生物与食品工程系,安徽蚌埠233030;蚌埠学院生物与食品工程系,安徽蚌埠233030;蚌埠学院生物与食品工程系,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】TS201.2【相关文献】1.鬼针草抑菌物质提取及抑菌活性研究 [J], 滕蓉;李清禄;张温玲2.百里香多酚的提取工艺优化及抑李斯特菌活性研究 [J], 王娣;许晖;柯春林;李妍;曹珂珂;谢海伟3.棘托竹荪抑菌物质的乙醇提取工艺优化与抑菌作用 [J], 张爽;张璞瑜;蒋达青;张媚;张立钦;林海萍4.棘托竹荪抑菌物质的乙醇提取工艺优化与抑菌作用 [J], 张爽;张璞瑜;蒋达青;张媚;张立钦;林海萍;5.超声波辅助提取长裙竹荪抑菌物质工艺优化及其抑菌活性研究 [J], 张永杰;江丽慧;潘明;唐甜甜;陈存;张薇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中草药提取工艺优化及其体外抑菌的研究
第 ２ ９卷
０
１ ３ 提 取物 制备 ．
１ ３ １中草 药水提 物制备 ．． 分别 将 ６种 中草药粉 碎 ， 称取 ５ ， 水 ６ 各 加 ｇ ０ ｍＬ， 煮沸 后文 火煎 ３ ｉ ， 滤纸 过滤 药液 ， 渣重 煮 ０ｒ ｎ 用 ａ 药
第３ 期
林 丽超 等 ： 中草 药提 取 工 艺优 化及 其体 外抑 茵 的研 究
８ １
苦 参水 提物 ＭＩ Ｃ值 为 ５ ／ ０ｍｇ ｍＬ， 金 黄色葡 萄球 菌抑 菌作 用 相对 较弱 。中草 药水提 物对 大肠 杆菌 的 对 ＭＩ Ｃ值 只有黄 芩 水 提物 为 ２ ／ ５ｍｇ ｍＬ， 他 ５种 为 １ ０ｍｇ ｍＬ， 明 中草 药 水 提物 对大 肠杆 菌 抑 茵作 其 ０ ／ 说
１
９
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１
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３
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３ ７． ２９
１ ５８ ４． １ ．５ ４ ８
１ ．５ ４ ８
１１ ４ ．６ ２ ．Ｏ ５ ０
ｌ ．４ １ ６ １ ．４ ０ ２ １ ．６７ ６
１ ６７ ６．
７． ２９
１０ ２ ．４ ９ ８ ．３
大黄、 山楂 、 参 、 苦 薄荷 、 黄芩 、 黄柏 ， 自佛 山市 中医 院。 ’ 购
１ １２ 培 养基 的制备 ． ．
营养培 养基及 葡 萄糖 肉汤 为广东 环凯微 生物 科技 公 司生产 。 常规法 配制 ， 按 灭菌 后 置 ４Ｃ冰箱 保存 。
备用 。
１ １ ３ 试 验 菌株 ．．
１ ３ ３ 茵 液 制 备 ．．
金黄色葡 萄球 菌和大肠 杆菌 用营 养琼脂 培养基 平板 ３ Ｃ培 养 １ ￣２ ， ７。 ８ ４ｈ 选典 型菌 落接 种 于 １ 葡
快速检测食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素型的研究进展
株能够产两种或两种以上的肠毒素。金葡菌毒素是一种 外毒素 ， 具有耐热性 ， 是结构相似的一组可溶性蛋 白质， 由多个无分枝的多肽链组成。除了 Ａ Ｂ ｃ ｃ型又按等 、、（ 电点不同分为 ｃ 、：ｃ ） Ｅ共 ５ 已被鉴定的血清型 ，ｃ 、，Ｄ、 种
染菌 ， 以其存在范 围广、 致病性强而广受人们关注。 目
前， 我国仍使用传统方法对乳中的金葡菌进行检测， 因检
测周期长而加大了生产成本 ， 因此 ， 开发准确性高、 检测 周期短的检测方法显得尤为必要。以下着重介绍了一些 快速检测金葡菌及其毒素型方法的研究进展。
２ １ Ｐ ｔｆｍ Ｒ Ａ 检 测 法 ． ｅ ｉｌ Ｓ ｒ ｉ Ｐｔｆｍ Ｒ Ａ Ｃ ｕｔ ｅ ｉ Ｓ ｏｎ ｎｌ
”ｌ 该检 ｌ 驯
进行了检测 ， 该方法的标准曲线的相关性都达到了 ０９ ．８ 以上， 研究结果表明实时定量 Ｐ Ｒ的检测限为 ８ ｕ ｍ ， Ｃ ３ｅ ／ Ｌ ｆ 实时 Ｐ Ｒ引物和探针的设计是保证特异性的重要环节。 Ｃ 张红河等 选择 Ｆ ｍ 、Ｅ ｅ Ｂ Ｓ Ａ和 Ｓ Ｄ基 因分别作 Ｅ
外， 还有 Ｆ Ｈ、、、 、 Ｎ及 Ｓ 、 ＩＪＬ Ｍ、 Ｔ一１ ８种新型肠毒 共
素 ” ， 中 Ａ型肠毒素毒力最强 ， 其 人体摄入 １ ／ ｇ ｇ ｋ
即能引起 中毒 ， 以 Ａ型肠毒素引起 的食物 中毒最 常 所
见， 相比之下 ， Ｄ型毒力较弱 ， 人体摄人 ２ ｇｋ 才引起 ５ ／ｇ 中毒 …。除了常见的呕吐、 腹泻腹痛等 急性 中毒症状
ａｔｎ（ Ｃ ， ｄＰ ＲＷ ｏｔ ｓｄｆ ｓｙｎ ｅｅｔ ｏｏｉ ｆ ｔ ｈｌ ｏｃ ｌ ｕ． ｃ ｏ Ｐ Ｒ） ａ Ｃ ａ ｍ ｓｙｕｅ ｒ ａｉｇｔ ｎｅ ｔ ｎｏ ａ ｙ ｃ ｕ ａ２ｓ ｉ ｎ ｓ ｌ ｏ ａ ｓ ｈ ｒ ｘ Ｓｐ ｏ ｓ １ ｃ ＂ ｅ
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金黄色葡萄球菌肠毒素产量的优化工艺金黄色葡萄球菌肠毒素产量的优化工艺杨玉涛专业：食品科学与工程学号：2007464211 指导老师：张英慧摘要：实验旨在探求金黄色葡萄球菌肠毒素的产生情况、测定方法以及制备最佳工艺。
选取标准金黄色葡萄球菌纯化菌种，依国标GB/T4789-10-94液体透析培养法进行肠毒素的培养提取，根据肠毒素的蛋白质特性，利用紫外光分光光度法跟踪肠毒素的产量曲线。
结果显示在产毒培养48h，振荡培养温度为40℃，菌种培养30h条件下肠毒素产量最大，单个菌落肠毒素产量为14.505mg。
生产工艺中产毒培养时间和振荡培养时间以及菌种培养时间对肠毒素产量的影响较大。
关键词：金黄色葡萄球菌；肠毒素；产量；优化工艺Abstract：The purpose was to explore the production situation, assay method and the preparation technology of staphylococcal enterotoxins. The standardard production method of Staphylococcus aureus was chosen according toGB/T4789-10-94, and the output was assessed by ultravioletspectrophotometry. The results showed that the largest production of staphylococcal enterotoxin was 14.505mg per colony. The optimium process was shaking toxicogenic incubation at 40℃for 48 h, followed by strain incubation for 30 h. And the time of oxicogenic incubation, shaking culture and strain incubation exerted great influence.Key words: Staphylococcus aureus; Staphylococcal enterotoxins; output; optimium process恶性肿瘤（简称肿瘤）是威胁人民健康、危及人民生命的严重疾病。
据统计，对于最佳工作时期（35-60岁）人群死因调查中肿瘤居首位。
在我国，近年来癌症死亡率顺位上升，城市已是第一位，农村是第三位。
人们经过一个多世纪的努力，还是没有征服癌症。
1981年，世界卫生组织癌症顾问委员会指出：利用掌握的方法和技术，1/3的癌症是可以预防的，1/3的癌症如早期诊断是可以治愈的，1/3的癌症是可以减轻痛苦，延长寿命的。
30多年已经过付出了，总体上来说这个论断没有成为现实，世界范围的癌症发病率和死亡率仍在上升。
但随着医学的进步和发展，使大约80%~90%的癌症得到确诊，而且使1/3的癌症患者能在早期被发现。
这些早期癌症患者中，90%可以得到根治。
目前，对SE已有广泛的基础研究。
在这一方面我国科研人员已经在SAg的研究上作了大量的基础与临床应用工作，从金葡菌代谢产物中提取抗肿瘤的有效成分，在带不同癌瘤的动物体上进行了不同剂量的抗肿瘤临床观察，已取得了较满意结果。
利用基因重组技术提示，各剂量的重组SEA均能显著抑制肿瘤的生长(P<0.001)。
重组SE的高、中、低剂量治疗组的抑瘤率分别为79.3%，75.6%，73.8%，而中剂量原位注射的抑瘤率高达90.6%。
这提示超抗原靶向治疗较直接利用，其抗癌效果更好[1]。
程慧桢等[2]用金黄色葡萄球菌肠毒素协助无水酒精局部注射治疗肝癌发现能够增强肝癌患者局部抗肿瘤细胞免疫；肿瘤患者局部细胞免疫影响其预后状态；能够进一步降低该治疗方法治疗原发性肝癌的近期复发率。
Perabo等[3]对SEB应用于膀胱癌的灌注治疗进行了临床前评估，结果表明SEB能够有效杀伤肿瘤且未见毒副作用出现。
在本研究中，用SEA注射荷瘤小鼠，能够有效抑制肿瘤的生长，而尤以中剂量原位注射(每只鼠110 ng)效果最佳。
这表明，将SAg进行局部给药或加以靶向修饰，可较好地应用于肿瘤的治疗。
也正由于SE具有独特高效的诱导机体抗肿瘤免疫反应的特性，把它作为抗肿瘤生物制剂，应用于抗肿瘤疗法中，将会有广泛的应用前景，也必将会取得更快更显著的进展[4,5]。
因此，研究肠毒素尤其是开展肠毒素的检测以及量的提取扩增，可用于肠毒素的疾病预防和抗癌产品的研发，对于临床医学抗肿瘤有重要意义。
本试验主要工艺是采用国家标准GB/T4789-10-94规定的金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法中的液体透析培养法进行肠毒素的提取，并利用紫外分光光度法进行肠毒素产量的测定[6]。
利用正交设计选取出肠毒素产量最大化的工艺条件，方便以后抗癌产品的制备。
1 材料与方法1.1 材料和试剂金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923-3）；营养琼脂；氯化钠；蒸馏水；透析袋（截留分子量14000，规格：扁宽2.5cm；上海源聚生物科技有限公司，批号：080406）；肠毒素产毒培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，产品编号：HB4120）；标准牛血清白蛋白（BSA）（上海伯奥生物科技有限公司，编号：G0050）；细麻绳。
1.2 设备和仪器1.2.1 仪器试管（180mm x 18mm）、250ml锥形瓶、棉花塞、胶头滴管、玻璃棒、石棉网、小烧杯、接种环、移液管、吸球、离心管、量筒、酒精灯1.2.2 设备电子万用炉（北京市永光明医疗仪器）；手提式压力蒸汽灭菌器YX-280B型（合肥华泰医疗设备有限公司）；单人净化工作台SW-CJ-1D型；振荡培养箱PYX-190Z-C型（科力仪器）；恒温培养箱培养箱PYX-250H-B型（科力仪器）；离心机Anke TGL-16G(上海安亭科学仪器厂)；Spectrumlab 752S 紫外光分光光度计；T500型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）。
1.3 方法和原理1.3.1 方法采用GB/T4789-10-94中规定的液体透析培养法从菌体培养液中提取出肠毒素，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种蛋白质，所以采用紫外吸收法测定溶液中蛋白质的含量来测定溶液中金黄色葡萄球菌肠毒素的含量[7,8]。
1.3.2 原理金黄色葡萄球菌肠毒素都是简单的蛋白质，它们水解后能释放出18种氨基酸，其中赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸的含量最高。
因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收且各种肠毒素蛋白质在这三种氨基酸的含量差别不大。
因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法[9]。
1.3.3 步骤1.3.3.1 标准曲线的绘制将常用的标准蛋白质牛血清白蛋白（BSA）制成浓度为1.0mg/mL的溶液取6支试管，按编号加入试剂；用第一管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度上测定吸光度A280，以A280为纵坐标各管的蛋白质浓度为横坐标作图[9]。
1.3.3.2 产毒培养时间对肠毒素产量的影响将金黄色葡萄球菌菌株接种营养琼脂斜面，培养24h，再加入已制备好的产毒培养基中，在37℃下振荡培养如图2中不同时间段，测定肠毒素的浓度，经计算得出肠毒素的含量如图2。
1.3.3.3 不同处理条件下对肠毒素产量的影响研究三个因素（如表1）共同作用对肠毒素产量的影响，选取产量最多的水平搭配。
进行正交设计试验，选取的不同处理条件如表2表1 不同处理条件的三因素四水平因素水平产毒培养时间（h）244860振荡培养温度（℃）25303540菌种培养时间（h）122430表2 正交设计三因素四水平的搭配不同处理代号产毒培养时间（h）振荡培养温度（℃）菌种培养时间（h）12425122 24 30 183 24 35 24 4 2440 30 5 36 25 18 6 36 30 127 36 35 30 8 36 40 24 925 24 10 48 30 30 11 48 3512 48 40 18 13 60 25 30 1460 30 24 15 60 35 18 16 60 40122 结果与分析2.1 标准曲线的绘制用紫外分光光度计测得各个试管中标准蛋白质牛血清白蛋白（BSA）的A280值，绘制成标准曲线图为图1。
图1 蛋白质浓度标准曲线从中可以直观的得出该标准曲线的回归方程式为y=0.7101x + 0.0048,R2=0.9998>0.95,精确度高。
从此方程式中，可以利用测得的OD值直接算出肠毒素的浓度。
2.2 产毒培养时间对肠毒素产量的影响从图2中可以得出在其他条件固定不变的情况下，仅考虑产毒培养时间与肠毒素产量的关系。
从单因素方差分析标记结果中得出0h-48h之间互呈显著关系，整体呈上升趋势，而48h-64h之间肠毒素产量趋于略微上升的稳定状态，但差异不显著。
从图表分析中直观看出肠毒素的产量从刚开始的0mg到8h、16h、24h，缓慢上升，24h至32h之间，产毒量增加较多。
之后产毒培养48h、56h时肠毒素的产量趋于稳定，达到最高峰，产量为3.447mg（按接种单个菌落培养计）。
因此，就单因素试验中，产毒培养时间为48h时，肠毒素的产量最大，为单因素的最佳条件。
图2 产毒培养时间与肠毒素产量的关系图3 三因素正交试验对肠毒素产量的影响2.3 不同处理条件下对肠毒素产量的影响将经过不同处理的提取液倒入石英比色皿中，用蒸馏水做空白对照，在紫外分光光度计上直接读取280nm的吸光度值A280，利用标准曲线查出提取液中肠毒素浓度，在通过计算得出肠毒素的量。
不同处理条件肠毒素产量如图3。
本试验属于正交设计的完全随机模型，从图3中正交设计方差分析表看到三个因素的F值明显大于F临界值，由此得出这三个因素极显著，说明产毒培养时间、振荡培养温度、菌种培养时间这三个因素对试验效果影响较大。
从试验处理因子1（产毒培养时间）各水平间差异显著性检验中得出该因子各水平间极显著；从试验处理因子2（振荡培养温度）各水平间差异显著性检验中得出第一个水平和第三个水平不显著，其他水平间差异显著；试验处理因子3（菌种培养时间）各水平间差异显著性检验中得出该因子各水平间差异极显著；从试验处理因子4和5（空闲因子）各水平间差异显著性检验中得出部分水平间仍有显著差异，由此说明试验结果存在一定误差，主要是因为本试验结果的数据比较小，故存在的试验误差较大。