【开题报告】金黄色葡萄球菌产肠毒素的研究

开题报告食品质量与安全金黄色葡萄球菌产肠毒素的研究一、选题的背景与意义金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）(以下简称金葡)是动物和人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然界中分布广泛，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可能存在［8］，因而食品特别是牛奶及奶制品受其污染的机会很多。

金葡菌最常见的污染是通过化脓性皮肤疾病、上呼吸道炎症、口腔内疾病的人，以及健康人咽喉和鼻腔内带菌，经与食物接触或者通过空气传播而污染食物，并在其中繁殖和产毒。

金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶的数量，当金葡菌污染了含淀粉和水分较多的食品时，在温度等条件适宜时，经10小时左右即可产生相当数量的肠毒素，据估计，进食者吃下约100g的肠毒素A即可出现食物中毒的症状。

因此食品和食品原料中污染有金葡菌就有可能产生肠毒素，就有食物中毒的潜在危险。

葡萄球菌毒素（SE）是食物中毒最常见的原因之一，它引起的食物中毒症状主要是呕吐和腹泄，这些毒素蛋白质的结构主要为金葡菌的次生代谢产物。

虽然热处理可破坏葡萄球菌，但致病毒素对热稳定，可在热处理过程中保持甚至增加活性，100℃加热30分钟仍不失去其活性，因此金葡菌一旦污染了食品并在其中产生了肠毒素，用一般的烹调方法将活菌体灭活后，也不能将肠毒素破坏，必须加热100℃两小时才能破坏其毒性。

而对于冷冻食品，由于其制作及保藏处于温状态，所以更易感染金葡菌。

金葡菌肠毒素还有一种特点是对蛋白酶有耐性，在活性阶段可抗蛋白水解酶水解，故在水货道中也不易被破坏，因而食品极易被金葡菌污染极易引起食源性疾病的爆发。

金葡菌繁殖、是否产毒和产毒程度与食品的性质和组分密切相关，金葡菌污染食品后，如果被污染食品具备产毒条件时，就会产生肠毒素，对产品造成更进一步的污染，一般地，在PH6.0-8.0、水分含量较多、蛋白质或者淀粉比较丰富的食品中，在温度等条件合适的情况下，该菌最容易繁殖并产生毒素，并且当氧分压较低时肠毒素较易形成，而冻虾仁具备金葡菌的繁殖和生产的主要条件。

即使通过物理或者化学的方法将产口中的金葡菌完全灭活，但其中肠毒素仍不容易被破坏，因此产品也你存在肠毒素污染的危险。

如今，国内外贸易增多，国外食品和食品原料大量进入我国市场，检验局经常从进口的冷冻虾仁中检验出金葡菌，因此该产品也有存在金葡菌肠毒素的危险，而对于此肠毒素未做过相应的检测。

因此研究冻虾仁中金葡菌和产生金葡菌肠毒素之间的关系，研究虾仁中金葡菌的产肠毒素条件，对于预示冷冻虾仁中是否有肠毒素，防止金葡菌产生肠毒素和改进虾仁后加工工序步骤有指导作用。

金葡菌是一种重要的致病菌，当它污染食品后，在适宜的条件下会产生金黄色葡萄球菌肠毒素。

因此，本实验拟调查研究冻虾仁中金黄色葡萄球的数量，按照国家标准方法GB/T 4789.10检测并计数。

同时采用Mini-VIDAS的葡萄球菌肠毒素（SET）试剂盒提供的方法提取产品肠毒素，根据酶联荧光免疫分析原理检测是否污染肠毒素，研究金葡菌和肠毒素间存在的关系。

在虾仁中感染接种入金葡菌，初步研究虾仁中金葡菌的产毒情况，包括培养时间和培养温度等条件的影响，为现实条件中的产品存放和安全食用供指导。

二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：1、金黄色葡萄球菌致病性研究金黄色葡萄球菌污染食物后，不仅使其腐败变质，而且部分细菌产生肠毒素，引起食物中毒。

金葡菌具有多种蛋白质抗原，常用于食品检测的有葡萄球菌肠毒素和葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A,SPS）,葡萄球菌肠毒素是一组结构相关，毒力相近的胞外蛋白质，迄今为止从血清上已被鉴定的SE有10种：A，B，C，D，E，G，H，I，J，K型，其中C型抗原又根据等电点的不同分为3个严型（C1，C2，C3），其中肠毒素A是分子量为27KD的单体蛋白，它是葡萄球菌食物中毒最常见的类型，D，B，C次之［4］。

肠毒素可与相应的抗毒素特异性结合。

因此，采用其中之一有可检测标记的，特异性的单克隆或多克隆抗体，与样品中肠毒素结合，结果可采用比色、放免、荧光检测，或采用凝集、沉淀等肉眼可观察的免疫学现象来判断肠毒素的有无。

A蛋白存在于葡萄球菌的表面，具有种属特异性，无型别特异性，能与人与多种哺乳动物的免疫球蛋白IgG和Fc片段结合。

因此可采用IgG包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来检测金葡菌的有无。

按照国家标准GB/T4789.10-2008的附录B中，对金葡菌肠毒素的检测，采用酶联免疫分析法（ELISA）方法，预先将肠毒素的抗体（单价或多价抗体）与载体吸附。

当加入待检样品后，如样品中含有肠毒素，即可与之特异性结合。

再采用第二抗体（抗抗体）与抗原抗体复合物结合，形成抗原——抗体——抗抗体三层“夹心”结构，而抗抗体上标记有某种酶（如碱性磷酸酶、过氧化物酶等），最后加上该酶的底物使之显色。

根据颜色深浅进行定性或定量检测。

利用该方法的已经有多种商品化的试剂盒，提供已吸附单价或多家抗体的微孔板，以及阴性、阳性对照等。

此法灵敏（0.5mg/mL），专一，操作简单而快速（约4个小时）。

但其缺点是由相关抗原引起的交叉反应或内源性过氧化物干扰酶，肠毒素蛋白可能会凝集，而降低反应原性（仍保持毒性），造成假阴性。

2、肠毒素检测（ELFA）VIDAS SET2试剂盒是用自动化VIDAS设备进行酶联荧光免疫分析（ELFA）以测定葡萄球菌肠毒素。

小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌毒素肯有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等优点。

VIDAS食品自动完成全冲毁实验程序。

将食物提取物加于试剂条上，样品将在SPR内定时循环，样品中的葡萄球菌肠毒素与包被在SPR内侧的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体结合，未结合的样品则被洗去。

抗体——碱性磷酸复合物通过SPR循环并与SPR内壁上的任何肠毒素抗原结合，最后洗去未结合复合物。

荧光底物（4—甲基—香琣素—磷酸酯）在SPR内外反复循环，SPR上存留的酶催化底物分解为荧光底物（4—甲基—伞形酮）。

VIDAS的光扫描仪在450nm处自动测定荧光产物。

试验结束时，计算机自动分析结果并打印报告，得出检测并与阈值比较，得出最终解释（阴性或阳性）。

该方法只需简单的提取后，VIDAS SET2试剂盒可直接用于筛选食物中任何一种肠毒素的存在，实验室全自动化，80分钟可获得结果。

该方法可以弥补国家标准中的检测金黄色葡萄球菌肠毒素时的提取困难，试剂来源难，保存时间短，毒素检测样本少而导致试剂盒过期，操作繁等问题而无法检测此毒素的空白，弥补了用金黄色葡萄球菌计数来确定是否为此菌引起食物中毒过程中由于标本量太少及一些特殊改善标本而无法进行计数的缺陷。

尽管目前用小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌肠毒素还不能分型，但对判断此菌引起民的食物中毒的诊断起到简便操作并明示作用。

三、研究的方法与技术路线：1 细菌分离检验金葡菌的检测：金葡菌能耐受10%～15%的氯化钠，对温度适应强，最适温度35-36度。

多数能产生溶血素、血浆凝固酶，以及卵磷脂，热稳定核酸酶、磷酸酶、脲酶，还原亚碲酸钾、还原硝酸盐，发酵甘露醇产酸、触酶阳性、产生金黄色或柠檬色色素。

1.1金葡菌的定性检测金葡菌的检测根据GB/T4879.10方法来检测。

样品接种。

4%氯化钠胰蛋白胨肉汤，培养后转接Baird-Parker琼脂和血平板。

金葡菌在Baird-Parker平板上典型菌落为圆形光学的灰黑色菌落（因还原亚碲酸钾生产碲，所以菌落呈灰黑色），直径1—3mm，边缘颜色较浅，周围有透明圈（因含卵磷脂酶分解培养基中的卵黄所致）。

在血平板上典型菌落为圆形光滑的金黄色或者黄白色菌落。

直径2—3mm，周围有溶血圈（因含溶血素所致）。

血浆凝固酶试验：将可疑菌落转接到营养肉汤中，培养物加入到1：4的兔血浆中36度放置2—6小时，试管中呈凝块者，为血浆凝固酶试验阳性，同时以阳性菌株及内分泌作为对照，血浆凝固酶试验采用商品化的北京陆桥公司生产的冻干血浆。

可疑金葡菌进行镜检：为革兰氏阳性球菌，直径0.8~1um的不规则成堆排列，类似葡萄串，无芽孢。

挑平板上的可疑菌进行血浆凝固酶实验并进行VITEK生化鉴定。

报告样品中是否含带金黄色葡萄球菌。

1.2 虾仁产品中的金葡菌的定量检测取25g样品于225ml生理盐水中稀释均匀，并取该1ml十倍稀释液涂布于Baird-Parker琼脂平板培养48小时进行可疑菌的计数及鉴定，可疑菌的判断同上。

可疑菌同时分离纯化，接种于血平板上，并进行VITEK生化鉴定。

根据结果报告样品的金黄色葡萄球菌含量（CFU/g）。

2肠毒素中的毒素提取与检测毒素提取后采用酶联免疫荧光分析方法，用全自动免疫荧光分析仪（mini-VIDAS）检测。

提取的方法：生肉、海产品与熟肉：1. 称取25克的样品加入25ml蒸馏水。

2. 反复混匀以得到均匀悬液，如悬液过稠，再加25ml蒸馏水混匀。

3. 回收全部的提取液。

4. 使用5%的盐酸调整PH值至4.0。

5. 18～25摄氏度静置15～30分钟。

6. 将悬液18～25摄氏度，3000—5000转，15min离心。

7. 使用1%氢氧化钠调整滤液P至7.5—8.0之间。

取0.5ml离心上清液作为毒素样品，放入VIDAS SET2试剂条的样品孔中，测定肠毒素。

80min后自动出结果。

判断肠毒素有无及其强弱程度。

综合以上实验得出结论。

四、总体安排与进度：2010年11月查找资料，撰写综述和开题报告。

开题答辩。

2010年12月翻译外文文献201年1月确定实验方案，准备材料和实验仪器，开展实验。

2011年2至3月处理数据2011年5月撰写毕业论文，准备论文答辩五、主要参考文献：[1]胡荣华，徐景野，速冻食品中金黄色葡萄球菌污染调查及存活观察［J］中国食品卫生杂志，2002，Vol 14,No 4,37-38[2]向阳，食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的检测方法［J］，中国食品学报，2002，Vol。