金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)适配子的筛选和应用
26612637_金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E_重组载体的构建及表达
生物技术进展2022年第12卷第2期313~317Current BiotechnologyISSN 2095‑2341研究论文Articles金黄色葡萄球菌肠毒素A 、B 、C 、D 、E 重组载体的构建及表达陈威风1，崔丽伟1，常惟丹1，朱龙佼2，许文涛2*1.河南牧业经济学院食品与生物工程学院，郑州450046；2.中国农业大学营养与健康系，北京100083摘要：金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins ，SEs ）是一组结构毒力相似、血清型不同的可溶性小分子蛋白质，平均分子质量为26~30kD ，是引起细菌性食物中毒及肠胃炎的主要因素之一。
为了制备金黄色葡萄球菌肠毒素的纯品，首先合成了SEA 、SEB 、SEC 、SED 和SEE 的基因序列，然后构建了5种肠毒素的原核表达载体，分别转入BL21（DE3）细胞中进行诱导表达。
通过SDS -PAGE 和Western blot 验证，5种肠毒素蛋白均被成功表达，并且在较低的诱导温度（16℃）获得一定量的可溶性蛋白。
成功制备了5种金黄色葡萄球菌肠毒素的可溶性蛋白，为今后更好地解决因SEs 引起的食品安全问题奠定了基础。
关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素；食物中毒；原核表达载体；可溶性蛋白DOI ：10.19586/j.2095‑2341.2021.0136中图分类号：Q939.121，R378.1+1文献标志码：AConstruction and Expression of Recombinant Vectors of Staphylococcal Enterotoxins A,B,C,D and ECHEN Weifeng 1，CUI Liwei 1，CHANG Weidan 1，ZHU Longjiao 2，XU Wentao 2*1.School of Food and Biological Engineering ，Henan University of Animal Husbandry and Economy ，Zhengzhou 450046，China ；2.Department of Nutrition and Health ，China Agricultural University ，Beijing 100083，ChinaAbstract ：As one of the main factors causing bacterial food poisoning and gastroenteritis ，Staphylococcal enterotoxins （SEs ）is a group of soluble small -molecule proteins with similar structural toxicity and different serotypes with the average molecular mass of 26~30kD.To prepare pure products of SEs ，the gene sequence of SEA ，SEB ，SEC ，SED and SEE were synthesized ，then the proraryotic expression vectors of five enterotoxins were constructed and transferred into BL21（DE3）cells for expression.SDS -PAGE and Western blot showed that the five enterotoxin proteins were successfully expressed ，and a amount of soluble proteins could be obtained at a lower induction temperature （16℃）.In this study ，five soluble proteins of Staphylococcal enterotoxin were successfully prepared ，which laid a foundation for better solving the food safety problems caused by SEs in the future.Key words ：Staphylococcal enterotoxins ；food poisoning ；prokaryotic expression vectors ；soluble proteins金黄色葡萄球菌是自然界中最常见的导致细菌性食物中毒的病原菌之一［1-2］。
葡萄球菌A型肠毒素的高效表达和分离纯化
・研究报告・葡萄球菌A型肠毒素的高效表达和分离纯化3姜永强1,郑玉玲1,宁保安2,马 茹1,王景林1,高志贤2(1.军事医学科学院微生物流行病研究所,北京 100071;2军事医学科学院卫生学和环境医学研究所,天津 300050)摘 要 根据已知葡萄球菌A型肠毒素(SEA)的基因序列,用PCR从产毒标准株S.aureus FRI100中扩增得到约700的SEA基因片段,并将该片段克隆至表达载体pBV220中,实现了高效表达。
表达产物以可溶性形式存在,表达的毒素用CM2Sephrose FF离子交换层析进行纯化,获得了高纯度的重组SEA,SDS2PA GE显示单一条带。
EL ISA 试验证明所获重组SEA具有与天然SEA相似的免疫学性质。
关键词 葡萄球菌A型肠毒素;表达;纯化中图分类号 R378.1+1 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2002)06-0005-02 葡萄球菌A型肠毒素(SEA)是金黄色葡萄球菌产生的系列肠毒素之一,是引起食物中毒的重要病原[1],同时作为超抗原,它可以刺激T细胞海量增殖并分泌细胞因子,是一种极好的免疫调节剂和细胞因子诱导剂,成为潜在的肿瘤免疫治疗药物。
我国已有含超抗原的粗制品(金葡菌除菌滤液)作为药物上市,具有确切的临床疗效[2]。
粗制品会导致额外的副作用,所以有必要采用超抗原纯化制品进行替代。
最早的超抗原纯化是从金葡菌发酵液中提取,首先进行产毒培养,然后进行分离纯化,但天然毒素产毒量低(20～200mg/L),并给后续的毒素纯化带来极大困难。
本实验试图以基因工程的手段制备表达量高、活性好的葡萄球菌A型肠毒素。
我们利用PCR技术从产SEA的金葡菌标准株中扩增了SEA序列,将该片段克隆至pBV220中,经热激诱导可在大肠杆菌获得高效表达,表达产物主要以可溶状态存在,约占菌体总蛋白的30%。
获得了高纯度的重组SEA,SDS2PA GE显示单一条带。
经免疫学实验证实,所获重组SEA基本保持其免疫原性。
金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法的建立及其应用
金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法的建立及其应用李倩;武军华;高珊;贾培媛;魏文青;王玉霞【期刊名称】《中国药理学与毒理学杂志》【年(卷),期】2018(32)10【摘要】目的建立一种敏感、特异、便捷的方法,用于检测食源性金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA).方法采用经典的细胞融合技术制备抗SEA的单克隆抗体,亲和层析纯化抗体蛋白,ELISA方法测定抗体滴度,免疫层析分析抗体亚型.以抗SEA单抗为一抗,建立Western印迹法,检测不同食物样品中的SEA.结果筛选出3株抗SEA的单抗,命名为SEA-7,SEA-18和SEA-86.纯化后的3株单抗纯度均>90％,抗体滴度均在1:32000,经鉴定均为IgG1亚型.利用3株单抗建立检测SEA的Western印迹法,SEA-7的检测灵敏度最高,可达1.56 ng.以SEA-7为一抗,可检测出不同食物中污染的SEA,如污染了1.56 ng SEA的水,污染了5 ng SEA的粥或火腿肠匀浆.结论建立的检测SEA方法可靠灵敏,可用于监测食源性金黄色葡萄球菌污染.【总页数】7页(P757-763)【作者】李倩;武军华;高珊;贾培媛;魏文青;王玉霞【作者单位】解放军总医院第七医学中心,北京 100700;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京 100850;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京100850;北京市疾病预防控制中心,北京 100031;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京 100850;解放军总医院第七医学中心,北京 100700;军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,北京 100850【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的应用及进展 [J], 任天红;刘景武;付素兰2.金黄色葡萄球菌肠毒素A胶体金定量检测方法的建立及应用 [J], 柴艳兵;张耀广;王莹;柳家鹏3.金黄色葡萄球菌肠毒素ELISA检测方法的建立及应用 [J], 李琴;王莹;柳家鹏4.金黄色葡萄球菌肠毒素SEK的纯化及DAS-ELISA检测方法的建立与应用 [J], 杨丹茹;赵燕英;唐俊妮5.利用特异性抗体建立金黄色葡萄球菌肠毒素B快速检测方法 [J], 周刘忠;胡乃静;张丁木;王志宏;吴佳果;罗龙龙;石艳春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定
金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定
王丽婵;张庶民;余模松;杨晓明
【期刊名称】《中国生物制品学杂志》
【年(卷),期】2006(19)2
【摘要】目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。
方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。
结果PCR扩增约
770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。
结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。
【总页数】4页(P120-123)
【关键词】超抗原;金黄葡萄球菌肠毒素;基因克隆;原核表达;金黄色葡萄球菌肠毒素A
【作者】王丽婵;张庶民;余模松;杨晓明
【作者单位】中国药品生物制品检定所;武汉生物制品研究所,武汉430060;武汉生物制品研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R378.11;R392.11
【相关文献】
1.重组金黄色葡萄球菌肠毒素A突变体D227A蛋白的表达、纯化和鉴定 [J], 张海英
2.金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、纯化与鉴定 [J], 汪宇;陆洪光;程波;余德厚
3.超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆与鉴定 [J], 郝林;韩从辉;王跃闽;贡震;董秉政;胡建鹏
4.金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达、纯化及鉴定 [J], 张琨;张月娟;万一
5.金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定 [J], 郑玉玲;宁保安;江华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
金黄色葡萄球菌肠毒素A在免疫应答中的作用
金黄色葡萄球菌肠毒素A在免疫应答中的作用王元元;胡艺丹;陈冬;兰景斌;吴明波【期刊名称】《成都医学院学报》【年(卷),期】2016(11)5【摘要】目的获得重组表达、纯化金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),并研究其免疫增强作用.方法利用基因工程法从金黄色葡萄球菌中克隆肠毒素A基因(sea),构建重组表达载体pET32a-sea,转化大肠杆菌(Rosetta)进行表达,并对其进行纯化;纯化后的SEA在白细胞介素2(IL-2)参与下,与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)进行动物免疫实验,检测其免疫增强效果.结果纯化后的SEA产量大约为40 mg/L菌液,SDS-PAGE分析在27 kD处有单一的目的条带;与对照组相比,SEA在IL-2的参与下与抗原共同免疫,抗体效价提高2.5倍.结论 SEA能够明显增强抗原的免疫应答效果.【总页数】4页(P550-552,572)【作者】王元元;胡艺丹;陈冬;兰景斌;吴明波【作者单位】成都医学院生物医学系,成都610500;成都医学院生物医学系,成都610500;成都医学院生物医学系,成都610500;成都医学院生物医学系,成都610500;成都医学院生物医学系,成都610500【正文语种】中文【中图分类】Q512【相关文献】1.金黄色葡萄球菌肠毒素对小鼠慢性哮喘模型的抗炎作用 [J], 李华;刘金保;陆丽;董伟华;沈守星2.重组金黄色葡萄球菌肠毒素B对禽流感灭活苗的佐剂作用研究 [J], 周晓芬;张金娟;毕丁仁;李自力;刘梅;肖运才;胡思顺3.金黄色葡萄球菌肠毒素在鼻窦炎鼻息肉发病机制中的作用 [J], 胡俐;王德辉4.金黄色葡萄球菌肠毒素A对H22小鼠移植瘤的抑制作用 [J], 王雪;孙嘉琳;张云;冯艳敏;陈自辉;李政楠5.低温等离子体对金黄色葡萄球菌肠毒素B的灭活作用 [J], 潘迪; 张大革; 孙运金; 马挺军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)说明书定性
金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)酶联免疫酶联免疫分析分析试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
96T使用目的使用目的：：本试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)表达。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)表达。
用纯化的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP 标记的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。
TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），与CUTOFF 值相比较，从而判定标本中金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的存在与否。
试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 阳性对照 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 阴性对照 0.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6显色剂B 液6ml ×1/瓶12密封袋1个标本标本要求要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。
操作步骤1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50µl 。
一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用[发明专利]
![一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/99aa87a3cf84b9d529ea7a9f.png)
专利名称：一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用专利类型：发明专利
发明人：张京顺,黄百芬,蔡增轩
申请号：CN202010345036.9
申请日：20200427
公开号：CN111518178A
公开日：
20200811
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于金黄色葡萄球菌肠毒素A检测的技术领域，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用。
本发明提供的金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，并设计合成了相对应的内标肽，所述内标肽是将所述标签肽中的氨基酸用C和N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸，本发明采用高效液相色谱‑质谱联用技术进行分析测定，从而测得食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量。
该方法具有良好的线性、灵敏度、回收率，可以直接定性和定量测定食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A。
申请人：浙江省疾病预防控制中心
地址：310051 浙江省杭州市滨江区滨盛路3399号
国籍：CN
代理机构：北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙)
代理人：王灿
更多信息请下载全文后查看。
金黄色葡萄球菌肠毒素A的原核表达及鉴定
金黄色葡萄球菌肠毒素A的原核表达及鉴定张琨;王军;万一【摘要】[目的]高效制备金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)用于SEA快速检测相关产品的研究.[方法]通过原核表达的方法表达SEA,对其纯化方法进行研究,通过Western-blot和制备的SEA顺磁微粒免疫层析快速检测试纸条检测其免疫原性.[结果] SEA成功克隆入原核表达载体pET22b(+),并在E.coil BL21(DE3)中得到有效表达,表达量达63.8％;采用低温诱导可获得可溶性的SEA,其表达量占总SEA 的56.3％;可溶性SEA经Ni柱亲和层析一步纯化可得到纯度在95％左右的SEA,Western-blot检测显示所纯化的重组SEA具有SEA的免疫原性.[结论]研究构建的SEA表达载体能够高效、经济、简单的制备SEA,纯化的SEA可用于食物中毒中SEA快速检测相关产品的开发,具有一定的应用价值.【期刊名称】《陕西农业科学》【年(卷),期】2016(062)008【总页数】4页(P27-30)【关键词】金黄色葡萄球菌肠毒素A;原核表达;纯化;鉴定【作者】张琨;王军;万一【作者单位】陕西省微生物研究所分子生物学研究中心,陕西西安710043;陕西省微生物研究所分子生物学研究中心,陕西西安710043;陕西省微生物研究所分子生物学研究中心,陕西西安710043【正文语种】中文金黄色葡萄球菌肠毒素( Staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类结构相关、抗原性不同、毒力相似、分子量在24-32KDa之间的胞外单链蛋白，金黄色葡萄球菌( staphylococcus aureus)的致病力主要取决于其产SEs的能力[1,2]。
SEs引起食物中毒的症状表现为腹泻、呕吐、腹绞痛，严重时可引起休克样症甚至死亡[3]。
目前已鉴定的SEs有SEA～SEF六类，肠毒素大多很稳定，不易被破坏，在金葡菌性食物中毒中以SEA最为常见，占75%左右，产毒量为50 μg·mL-1[4]。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
碱性磷酸酶 牛血清白蛋白 斑点杂交法 链酶亲和素标记磁珠 二甲基亚砜 脱氧核苷三磷酸 双链 DNA 溴化乙锭 乙基碳二亚胺盐酸盐 乙二胺四乙酸 酶联适配子直接检测法 酶联免疫吸附法
isopropylthio-β-galactoside
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
the dissociation constant lurib-Bertani medium
OD PBS PBMC PCR SA SEA SELEX
ssDNA Tris X-gal
英文缩略词表
ABRIVIATIONS
英文全称
中文全称
ampicillin
氨苄青霉素
alkaline phosphatase bovine serum albumin dot hybrds M-280 streptavidin dimethyl sulfoxide deoxyribonucleoside triphosphate double stranded DNA ethidium bromide ethyldimethy carbodiimide ethylenediaminotetracetic acid enzyme-linked aptamer direct assay enzyme-linked immunosorbent assay
福建医科大学硕士学位论文
1 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
目录
英文缩略词表………………………………………………………………………3 中文摘要……………………………………………………………………………4 英文摘要……………………………………………………………………………6 正文…………………………………………………………………………………9
参考文献……………………………………………………………………………40 综述…………………………………………………………………………………45 致谢…………………………………………………………………………………56
2 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
缩写 Amp Ap BSA DHA DM－S DMSO dNTP dsDNA EB EDAC EDTA ELADA ELISA IPTG Kd LB MTT
前言……………………………………………………………………………9 一、材料和方法…………………………………………………………12 二、结果…………………………………………………………………25 三、讨论…………………………………………………………………33 四、结论……………………………………… 蛋白为靶标，筛选出与其高 亲和力、高特异性结合的适配子群，并利用荧光标记的适配子监测各轮 ssDNA 富集库与 SEA 的结合力。 2. 以结合力最高的一轮筛选产物为模板 PCR 扩增后纯化，TA 克隆、测序后， 利用 Chromas 和 DNAman 软件分析序列的一级结构并模拟二级结构。 3. 分别以地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统和生物素-链霉亲和素-碱性磷 酸酶系统作为桥连建立酶联适配子直接检测法（enzyme- linked aptamer direct assay，ELADA）和斑点杂交法（dot hybridization assay，DHA），利用这两种 方法鉴定筛选出的适配子与 SEA 的亲和力和特异性。同时测定不同浓度适配 子与 SEA 的结合力，使用 GraphPad.Prism.v5.0 软件计算各候选适配子的解离 常数 Kd 值。 4. 以系列浓度的适配子同 SEA 共同刺激人外周血单核淋巴细胞，利用 MTT 法 测定 PBMC 的吸光度，并计算出刺激指数（SI）分析增殖活性。 【结果】 1. SEA与ssDNA富集库的结合力随着筛选轮数的增加逐渐提高。第9轮后结合力 从最初的5.8％上升至48.3％，提高了8倍，继续筛选将不再增加。 2. 将富集的第9轮产物进行克隆测序，成功的17个单克隆测序中共得到4条序 列，分别是：S3（3, 4, 5, 7, 9, 10, 14, 15, 18, 19）；S12（12, 16, 17, 20, 24）； S6；S23。软件模拟出各适配子的结构主要以发卡、茎环结构为主。
enrichment
single-stranded DNA
单链 DNA
tris（hydroxymethyl）aminomethane
三羟甲基氨基甲烷
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D- galactoside
5-溴-4-氯-3-吲哚-1-β- D-半乳糖
3 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
磷酸盐缓冲液 人外周血单核淋巴细胞
polymerase chain reaction streptavidin
聚合酶链式反应 链霉亲合素
Staphylococcus aureus enterotoxin A
金黄色葡萄球菌肠毒素 A
systematic evolution of ligands by exponential 指数富集配基的系统进化
解离常数 LB 培养基
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromide
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯 基四氮唑溴盐
optical density
光密度
phosphate buffered solution peripheral blood mononuclear cell
金黄色葡萄球菌肠毒素 A（SEA）适配子
的筛选及应用
中文摘要
【目的 】利 用指 数富集 配基 的系 统进 化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)技术获得能高亲和力高特异性结合金黄色葡萄球 菌肠毒素（SEA）的功能性适配子，为建立适配子快速检测 SEA 的方法奠定基 础，并为治疗金黄色葡萄球菌的感染提供新的思路。 【方法】 1. 体外合成中间为 40 nt 的随机序列，两端为固定序列，全长共 76nt 的 ssDNA