08第九章外源基因在真核细胞中的表达.
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制
外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制外源基因指的是不同于自身天然基因的DNA序列，也称为异基因。
它们通常来自其他生物体或者人工合成。
将外源基因导入真核细胞中，可以用于基因治疗等生物学应用。
但是，外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制是如何实现的呢？本文将从转录与翻译两个方面进行探讨。
一、外源基因的转录在真核细胞中，外源基因的转录需要利用细胞核内的RNA聚合酶Ⅱ及其辅助因子。
具体而言，首先，在外源基因导入真核细胞后，其中的DEAE（二乙氨基乙烷磺酰氯）结构可以与细胞核膜上的负电性磷脂结合，从而增加外源基因进入细胞核的概率。
其次，外源基因所带有的启动子因子通常与细胞内自身基因的启动子因子不同，因此，需要利用转录激活因子（transcriptional activator）来激活RNA聚合酶Ⅱ。
这些转录激活因子可以通过识别外源基因启动子上的绑定位点，与RNA聚合酶Ⅱ的载体克服反式构象的阻碍，使其启动并开始转录。
最后，转录过程中所合成的外源mRNA需要经过RNA后处理过程。
比如，转录的外源mRNA首先要剪切成正确的3’端与5’端，接着经过去除内含子、加上头部甲基等修饰，最终整合成成熟的mRNA。
这一过程让外源mRNA得以正常运作，供翻译酶读取序列信息。
二、外源基因的翻译外源基因的翻译与自身基因类似，需要使用细胞质内的翻译体系。
通常来说，外源蛋白的合成与自身蛋白合成的过程没什么不同，遵循着标准的mRNA翻译规则。
具体而言，首先，mRNA上的翻译起始密码子（AUG）被识别后，tRNA带着对应的氨基酸A（甲硫氨酰胺）进入到翻译终点—核糖体R（ribosome）上。
其次，核糖体R从mRNA的5’端不断向3’端移动，逐渐合成蛋白。
这一过程中，外源基因上的密码子和tRNA发生配对，tRNA合成链不断变长，新合成的肽链不断生长。
最后，当核糖体R到达mRNA终止密码子时，翻译过程终止，蛋白质合成结束。
需要注意的是，由于外源蛋白和自身蛋白在A、T、G、C序列的组合上并无区别，因此在翻译过程中往往会和自身蛋白一同被翻译和进入细胞质中。
分子生物学真核生物表达系统ppt课件
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
12.02.2020
6
三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
12.02.2020
19
（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
12.02.2020
20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
外源基因的表达
RNA聚合酶： 核心酶(α2ββ′)＋σ亚基＝全酶( α2ββ′ σ)
s factor:
7.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活 性的DNA顺式作用序列，又称强化子。
7.2.3 终止子(terminator )
本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特 殊的RNA结构区内实现终止作用。 依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅 助因子。
7.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序 列为CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱 基（A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成 对启动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动 子功能的重要因素。
基因表达在原核生物与真核生物中的差别 在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行 的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构 基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时， mRNA立 即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完 毕时转译也完成。 在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行 的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连 接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能 在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过 加工、糖化、形成高级结构。
The prokaryotic promoter
5’ -35 -10 16-19 bp 3’
TTGACA T82T84G78A65C54A45
TATAAT 5-9 bp
start site
T80A95T45A60A50T96 Transcriptional
实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释1.分配常数：又称分配系数,是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数.2。
多肽链的末端分析:确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。
3。
连接酶:指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶.4。
预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭,用以降低探针在膜上的非特异性结合。
5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术.首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。
6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。
7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因,从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代,然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。
8。
物理图谱:人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对（bp，kb，Mb)作为基本测量单位（图距）的基因组图。
9。
质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。
10.侧向散射光：激光束照射细胞时,光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11。
离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。
12。
Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。
13。
又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease）：是能够特异识别双链DNA 序列并进行切割的一类酶。
14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质,DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。
15。
多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程.16。
融合表达：在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签(Tag)，表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达）,方便后继的纯化步骤或者检测。
外源基因的表达和转基因生物的鉴定.
异源性表达（heterologous expression）则指来源于其它物 种的基因在植物中的表达。
异源表达困难的原因：是因为不同物种 RNA聚合酶所识别 的启动位点不同，因而造成异源表达困难的结果。
2、瞬时表达和稳定表达
瞬时表达（transient expression）：在受体中表达一个细胞 周期或一个培养周期，这种表达称瞬时表达。
1、胭脂碱和章鱼碱检测
这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物 材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱 和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的 荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有 胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。 冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）＋菲醌 2天后呈蓝色 紫外光下呈黄色荧光
稳定表达（stable expression）：转化的外源基因在细胞水平 可检测到它的产物，在个体水平也能检测到性状表现，并且 可稳定地遗传给后代，这种正常的长期表达称为稳定表达。
3、组成型表达和发育特异性表达
组成型表达（constitutive expression）指表达是持续的， RNA及蛋白质表达量也相对恒定，不受时空条件改变而改变， 也不因外界因素变化而诱导基因表达，相当于稳定表达。
第二节 平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导 转化体表现其性状特征或生理特征。
二、细胞和组织水平鉴定
报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断
外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检 测其表达活性的一类特殊用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中 应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会 损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测 特性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
成是必需的。对营养缺陷型dhfr－ 细胞来说，二
氢叶酸还原酶基因可用作选择标记，在缺少胸腺
嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中筛选出转化了的
细胞。
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
氨甲喋呤（ methotrexate, MTX ）和三甲氧 苄二氨嘧啶（ trimethoprim ）是二氢叶酸类似物，
是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，当培养基中
子量为 26,888Da ，其产生荧光的发色团是由 Ser65 ，
脱氢 Tyr66 ， Gly67 自身环化及氧化形成，形成时需
要氧，不需要酶催化。野生型 GFP 发射的荧光强度
较弱，人们通过突变来提高 GFP 的荧光强度，有实
验表明，当GFP S65T 的Ser65突变为Thr时，在转化
的BOSC23细胞中荧光强度比野生型增强18倍。
激光微束穿孔法
一定波长的激光束经聚焦后到达细胞表面时
其直径大约只有 0.5 ～ 0.7μ m ，这种直径很小但能
量很高的激光微束可引起膜的可逆性穿孔。具体 做法是：在荧光显微镜下找到适当的细胞，然后 用激光光源代替荧光光源，聚焦后发出激光微束 脉冲，细胞壁被击穿， DNA 分子随之进入细胞。
由于激光孔径小，为线粒体、叶绿体的遗传工程
转化率。
高电压短时间举例：5 KV 180μS
低电压长时间举例：300V 10~20min
显微注射法
显微注射法（ microinjection ）采用显微操
作系统、毛细管注射。常用于动物受精卵细胞
的转化，也可用于植物原生质体的转化。此法
的关键是受体细胞的固定，受体细胞常被固定
在微吸管上，或固定在琼脂中。
含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生 长受到抑制。有一种突变的DHFR，它不受MTX 的抑制，以它作选择标记，转化的细胞可在含 MTX的培养基上生长。
选择标记之二
胸苷激酶基因
tk－的宿主细胞在正常的培养基中可以生长，但 在含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸苷（T） 的培养基中不能生长。这是因为氨基喋呤抑制了二 氢叶酸还原酶的活性，导致细胞不能合成 TTP 。若 ＋ 将 tk 基因转入细胞内，在 HAT 培养基中培养，虽 然氨基喋呤抑制了核苷酸的从头合成途径，但培养 基中的次黄嘌呤可以通过补救途径转变成 ATP 和 GTP ，胸苷通过胸苷激酶的作用可以转变成 TTP （ CTP可以按正常途径合成），所以被 tk基因转化 了的细胞可以在HAT培养基中生长。
精氨酸、胭脂碱、章鱼碱三种物质的电泳迁移
率不同，精氨酸的最大，章鱼碱和胭脂碱的接近，
电泳 1 小时以上可将二者分开，章鱼碱的迁移率略 大于胭脂碱。 有时因细胞内缺乏冠瘿碱合成的底物，导致假 阴性结果。可在提取液中加入精氨酸，保温一段时 间后再检测冠瘿碱。
绿色荧光蛋白基因
绿 色 荧 光 蛋 白 （ green fluorescent protein ，
冠瘿碱合成酶基因
冠瘿碱合成酶是农杆菌Ti质粒上T-DNA区编码的 一类与冠瘿碱（如章鱼碱、胭脂碱、农杆碱、农瘿碱、 琥珀碱、甘露碱）合成有关的酶。从转化的细胞中提 取冠瘿碱，纸上电泳后用菲醌染色，紫外光下检测黄 色荧光，根据冠瘿碱的有无和多少，可知冠瘿碱合成 酶的表达情况。
报告基因之四
冠瘿碱的检测方法
二、DNA直接导入的
基因转化方法
1 聚乙二醇法 2 高压电穿孔法 3 显微注射法 4 基因枪法 6 脂质体介导法 7 激光微束穿孔法 8 超声波介导法 9 DEAE-葡聚糖法
5磷酸钙共沉淀法
10 原生质体融合法
聚乙二醇诱导基因转化
外源 DNA 加聚乙二醇（ polyethylene glycol ，
基因枪法
基因枪法（particle gun）是在钨或金颗粒 的表面吸附一层外源 DNA，用高压气体、电弧 放电蒸发液滴、火药爆炸等方法使加速颗粒射 出，可穿过植物细胞壁。该法的优点是操作迅 速、简单、金属微粒的喷射面广、转化频率高，
具有广泛的应用前景。
基因枪工作原理图
点火装置 高压放电 电极 水滴 载片 火药子弹 火药爆炸
选择标记之五
选择标记之六
抗除草剂基因
除草剂 PPT 是一种谷氨酸类似物，它竞争性 地抑制植物体内谷氨酰胺合成酶（GS）的活性。 谷氨酰胺合成酶催化下列反应，起到解氨毒的作 用。当PPT存在时，GS活性被抑制，细胞内NH4+ 积累，细胞中毒而死亡。
选择标记之六
抗除草剂基因
PPT 乙酰转移酶（ PAT ）可以催化乙酰 CoA 分
聚乙二醇诱导基因转化
受体细胞处于 M 期最好，因此时无核膜，
能提高转化率。加入运载体 DNA 也能够促进转 化，运载体 DNA 常用小牛胸腺 DNA 或鲑鱼精子 DNA，要求剪切成5～13kb大小。剪切可用注射 器来回吸注 DNA 溶液几次，然后通过电泳检测 剪切效果。
高压电穿孔法
在电击时加入PEG和运载体DNA可提高
PEG ）和二价阳离子（如 Mg2+ 、 Ca2+ 、 Mn2+ ）可 在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的 内吞作用导入细胞。用多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸 代替 PEG 也行，二价阳离子常用 CaCl2 或 MgCl2 。
植物细胞必须除去细胞壁，可用纤维素酶降解细
胞壁，在等渗溶液中分离得到原生质体。
GFP）基因取自维多利亚水母Aequorea victoria，广
报告基因之五
泛应用于细菌、酵母、动物和植物中。GFP在受到
395nm 紫外光或 490nm 蓝光照射时，会发出 509nm 的绿色荧光。因为GFP不是酶，检测时不需要加底
物，且没有毒性，所以可以用于活体检测。
GFP的性质
GFP是由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分
农杆菌的瘤诱导
根癌农杆菌从植物的伤口处感染，使感染处产生
冠瘿瘤（ crown gall）；发根农杆菌也是从植物的伤
口处感染，使感染处产生茎瘿瘤（cane gall），瘤上
因调控和转化基因的表达情况。报告基因一般
是一种酶的基因，对报告基因的要求是在受体
细胞中没有其产物，产物容易检测。
β-葡糖醛酸糖苷酶基因
β-葡糖醛酸糖苷酶（ β-glucuronidase， GUS） 是目 前 应用 最 广泛 的 报告 基 因之 一 。它 以 x-gluc （ 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β- 葡糖醛酸）为底物，催化产
塑料子弹
微粒
档板
靶组织
磷酸钙沉淀法
将外源DNA与CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液， 逐滴加入到不断搅拌的HEPES-磷酸钙溶液中，形 成 DNA －磷酸钙共沉淀复合物。然后用吸管将沉
淀复合物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，细
胞可将复合物吸收到细胞内，保温几小时后，用
新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养液继续培养，
三、农杆菌作载体的 植物转基因方法
农 杆 菌 属 于 根 瘤 菌 科 土 壤 杆 菌 属 （ Agrobacterium ），常用的两种植物基因工程载
体农杆菌是根癌农杆菌（ A. tumefaciens ）和发根
农杆菌（A. rhizogenes），其中根癌农杆菌是植物
转基因工程中应用最广泛的载体系统。
报告基因之一
生蓝色的5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝沉淀，可用来观察
转化基因的组织化学定位。还可以4-MUG（4-甲基
伞形酮葡糖苷酸）为底物，催化产生4-甲基伞形酮，
产物用荧光分光光度计测定，此法可测定基因表达 的强度。
氯霉素乙酰基转移酶基因
CAT 也能用作报告基因。用 14C 标记的氯 霉素、乙酰 CoA 与细胞、组织提取物反应，薄 层层析法分离反应产物，放射自显影可测得 CAT活性。
选择标记之三
新霉素磷酸转移酶基因
新 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 （ neomycin phosphotransferase Ⅱgene, nptⅡ）是一个来源于转座子Tn5 编码的分子量为 25KD的酶，它催化许多氨基糖苷类
抗生素（如新霉素、庆大霉素、卡那霉素、G-418）
的磷酸化反应，将 ATP上的 γ磷酸基团转移到抗生素 分子上，阻止了它们与靶位点 —— 核糖体的相互作 用，从而使这些抗生素失去对细胞的毒性。这类抗 生素的毒理作用是与叶绿体及线粒体核糖体的 30S亚
出哪些细胞被转化了，哪些细胞没有被转化。将一
个选择标记与外源目的基因连接，被转化的细胞就
带有选择标记。选择标记常用抗生素抗性基因，真
核生物细胞所用的抗生素与原核细胞有所不同。
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
二 氢 叶 酸 还 原 酶 （ dihydrofolate reductase,
DHFR ）对于真核细胞核苷酸（胸腺嘧啶）的合
基结合，阻止70S核糖体形成。
潮霉素磷酸转移酶基因
潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase，HPT）可使潮霉素B磷酸化而失去 毒性。潮霉素 B 可抑制核糖体的功能，使细胞 不能合成蛋白质，因此对大多数植物和动物细 胞因
氯霉素能抑制真核细胞线粒体中的蛋白 质 合 成 ， 而 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 （chloramphenicol acetyltransferase，CAT） 能使氯霉素乙酰化，从而失去毒性。
绿色荧光蛋白
The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
子上的乙酰基转移到 PPT 分子的游离氨基上，乙酰 化了的PPT失去对GS的抑制作用，从而使转化了pat 基因的植物表现出对PPT的抗性。 用硅胶G 薄层层析可以分离和分析乙酰化的 PPT ，