微生物脂肪酶的纯化方法概述
脂肪酶生产工艺
脂肪酶生产工艺
脂肪酶是一种重要的酶制剂，广泛应用于食品加工、制药、制糖、造纸、皮革、饲料等各个领域。
脂肪酶的生产工艺主要包括菌种筛选、发酵培养、酶液提取与纯化等几个关键步骤。
首先，菌种筛选是脂肪酶生产的起始步骤。
传统的方法是从环境中筛选出产酶能力强、耐受性好的菌株，如大肠杆菌、放线菌等。
随着现代生物技术的进步，可通过基因工程手段改造菌株，使其具有更高的酶活性和稳定性。
接下来是发酵培养，这是脂肪酶生产的核心环节。
首先，将选定的菌株进行预培养，使其进入活跃期。
然后将菌种接种到含有适宜营养物质的培养基中，并调节好温度、pH值、溶解氧和搅拌速度等发酵条件，促使菌株大量繁殖并产生酶。
在发酵过程中，可通过测定培养基中脂肪酶活性的变化，调节发酵条件以提高酶产量。
酶液提取是将发酵液中的酶分离和提取出来的步骤。
首先，通过简单的物理方法如离心、滤过等将固体颗粒去除。
然后，采用适当的预处理方法进行酶的初步分离，如酸碱沉淀、盐析、溶剂抽提等。
最后，通过纯化技术如层析、凝胶过滤、电泳等进一步提纯酶液，去除掉杂质和其他蛋白质。
脂肪酶生产工艺中的关键点在于发酵培养和酶液提取。
发酵培养涉及到菌株的选取和培养条件的优化，需要通过不断试验和改进，提高酶产量和酶活性。
酶液提取则需要采用合适的分离和纯化技术，以达到酶的高效提取和纯度的要求。
总的来说，脂肪酶的生产工艺主要包括菌种筛选、发酵培养和酶液提取等几个关键步骤。
这些步骤需要通过科学合理的操作和技术手段，不断优化提高，才能够实现高效、稳定地生产脂肪酶。
脂肪酶的分离纯化
脂肪酶——来源
脂 植物：油料作物的种子
肪
酶 的
动物：高等动物的胰脏和脂肪组织
来
源 微生物：细菌、酵母菌和霉菌
脂 提取法：从动植物器官或组织中提取
肪
酶 的 提
化学合成法：分析酶的氨基酸组成顺序 ,再用化学 方法合成
取
发酵法 ：利用微生物的生命活力 , 通过人工控制而
获得人们所需的酶--假单胞菌属，黑曲霉，米曲霉
脂肪酶——结构
• 绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组 成, His，Ser与另一种氨基酸残基(如Glu或Asp 等)
一起构成脂肪酶催化活性中心的三联体。
残基 261 和 257 的羰基氧原子 为Ca2+配基;顶端的α螺旋( 浅色 的) 表示“盖子”状结构。当脂 肪酶与界面相接触时,此盖打开, 通过亲电子域的创造导致脂肪酶 的构象改变,此亲电子域在丝氨 酸残基周围,由疏水残基的暴露 和亲水残基的包埋来完成。这种 结构有利于催化过程中底物对活 性中心亲和力的提高以及活性 中间体的稳定。
• （氮源）大豆粉 2 ％ (NH4)2 SO4 0.1 ％ （碳源）玉米浆 5 ％ K2HPO4 5.5 ％ 聚乙二醇壬基笨 醚 0.6 ％
微生物脂肪酶的发酵过程
无 菌 空 气
发酵液
脂肪酶的下游分离提取工艺
预处理 过滤 菌体 水洗
（破碎）
过滤
滤液+ 洗液（含酶稀溶液）
硫铵
超滤
无菌过滤
浓缩液 辅料
• “盖子”是两性分子结构，在关闭状态，酶的结 构是亲水端面对溶剂，疏水端朝向蛋白质的内部， 当酶转变到开放状态时，疏水端会暴露出来，隐 藏亲水残基团，在丝氨酸残基周围形成亲电子域， 引起脂肪酶的构象改变，增加了酶与脂类底物的 亲和性，并稳定了催化过程中过渡态中间产物。 酶分子周围通常保留一定量的水分，从而保证了 脂肪酶在油/水界面和脂相中的自体激活
脂肪酶的概述及应用
脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。
脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。
酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
脂肪酶的微生物生产技术综述
脂肪酶的微生物生产技术综述脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，在工业生产中具有广泛的应用。
传统的生产方法主要依赖于动物源脂肪提取，但存在成本高、工艺复杂等问题。
近年来，随着微生物生产技术的发展，利用微生物生产脂肪酶成为一种新的制备方法。
本文将对脂肪酶的微生物生产技术进行综述。
脂肪酶的微生物生产技术可以分为两大类：传统培养法和发酵工程法。
传统培养法主要是利用微生物本身产生的脂肪酶，在培养基中添加一定的诱导物质，刺激脂肪酶的合成。
常用的微生物有大肠杆菌、毕赤酵母、真菌等。
通过优化培养基成分、培养条件等因素，可以提高脂肪酶的产量和活性。
发酵工程法主要是通过基因工程手段改造微生物，使其能够高效表达目标脂肪酶的基因。
一般而言，利用真菌、大肠杆菌等基因工程菌株进行转基因技术的研究较多。
基因工程技术可以精确控制脂肪酶基因的表达，从而实现高效产酶。
同时，通过对菌株进行改造，还可以改善酶的稳定性、抗脂肪酸的能力等性能。
在微生物生产脂肪酶的过程中，存在一些关键技术需要克服。
首先是选择适宜的菌株。
不同的菌株对酶的产量和产酶条件有一定的要求，需要根据具体情况选择适宜的菌株。
其次是培养条件的优化。
如温度、pH值、培养基成分等因素对微生物生长和脂肪酶合成有重要影响，需要进行合理的调控。
此外，脂肪酶的分离纯化技术也是关键环节，通常采用离心、超滤、柱层析等方法进行分离纯化。
微生物生产脂肪酶的技术具有许多优点。
首先，可以避免对动物的依赖，减少对环境的影响，同时可持续生产，降低制备成本。
其次，基因工程技术的应用使得脂肪酶的产量和活性大幅度提高，可以满足工业需求。
此外，微生物生产脂肪酶的过程相对简单，易于规模化生产。
总之，微生物生产脂肪酶是一种新的制备方法，具有广阔的应用前景。
在今后的研究和开发中，需要进一步提高产酶菌株的稳定性和活性，改进酶的纯化技术，同时探索更多种类的微生物用于生产脂肪酶。
相信随着技术的发展，微生物生产脂肪酶的工艺将得到进一步完善和优化。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。
脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。
为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。
本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。
2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。
脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。
脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。
3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。
下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。
3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。
3.反应一段时间后停止反应。
4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。
•优点：方法简单、成本低廉。
•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。
3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。
3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、灵敏度较高。
•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。
3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。
2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。
3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、实时监测。
•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。
3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。
脂肪酶综述
五、脂肪酶的发酵生产及分离纯化
产脂肪酶发酵分两类: 固体发酵和液体发酵法。相对液体发酵法，固体发酵
生产脂肪酶具有简洁，经济的优点 。
影响菌株发酵产脂肪酶的因素有： 氮源、碳源、底物诱导剂、表面活性剂、矿物质、pH,
培养温度、摇床转速、培养时间、接种量等。
（1）发酵培养基
有机氮源:
大豆粉、大豆饼粉、大豆蛋白、业麻饼粉、奶粉、酪蛋白、蛋白陈、酵母膏、 牛肉膏、玉米浸汁和无机氮硫酸钱、硫代硫酸钱、氯化氨、磷酸氢氨、磷酸二 氢氨等
碳源
包括13种碳水化合物如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露糖等和15种油 脂如荷荷芭油、玉米油、豆油、棕搁油、橄榄油、业麻油等
表面活性剂
包括吐温系列、Span系列、Triton x-405等
发酵培养基优化
由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成 。
速效碳源
如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如 玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。
(2)最适pH及pH稳定性
脂肪酶最适pH受多种因素影响，如来源、底物 种类和浓度、缓冲液种类和浓度等。来源不同脂肪 酶，在一定条件下都有其特定最适pH和pH稳定范 围。大多数细菌脂肪酶的最适pH值在中性或碱性 范围内，稳定范围一般在pH值为4.0-11.0。真菌脂 肪酶pH值稳定范围较宽，如红曲酶保持基本活力 的pH值范围在pH4.0-6.0，少根根霉脂肪酶的酶活 在pH值为6.0-8.0的范围内都较稳定毛根霉脂肪酶 的pH值稳定范围为7.0-10.0。
大豆粉大豆饼粉大豆蛋白业麻饼粉奶粉酪蛋白蛋白陈酵母膏牛肉膏玉米浸汁和无机氮硫酸钱硫代硫酸钱氯化氨磷酸氢氨磷酸二碳源包括13种碳水化合物如葡萄糖淀粉麦芽糖乳糖甘露糖等和15种油脂如荷荷芭油玉米油豆油棕搁油橄榄油业麻油等表面活性剂包括吐温系列span系列tritonx405等发酵培养基优化由碳源氮源诱导物及常见的无机盐等组成速效碳源如葡萄糖蔗糖麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成而缓效碳源如玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一种通过加速脂肪的加水分解而使其水解成胆固醇、甘油、游离脂肪酸等组分的生物催化剂。
脂肪酶已经广泛应用于食品、乳制品、制药、皮革等行业，因此其生产研究具有重要意义。
微生物发酵是目前最主要的脂肪酶生产方法之一，本文详细介绍了微生物发酵生产脂肪酶的研究进展。
1. 常用微生物种类微生物发酵生产脂肪酶常用的微生物种类有真菌、细菌、放线菌、酵母等。
其中最常用的微生物是霉菌和细菌。
霉菌对不同类型的底物都具有良好的酶活性，但是其生长速度较慢，反应时间长。
细菌则生长速度快，能够迅速产生大量的酶，但是它们的适应能力较差。
2. 脂肪酶生产工艺流程微生物发酵法生产脂肪酶的具体工艺流程大致分为以下几个步骤。
（1）培养基的制备：首先需要制备含有所需营养物质的培养基。
一般来说，优质的培养基含有碳源、氮源、微量元素、维生素等。
（2）微生物的接种：将所选的微生物菌株接种到培养基中，并进行预培养。
（3）发酵过程中的条件调控：这一步的关键在于对发酵过程的控制，包括温度、pH 值、培养时间等因素。
（4）分离纯化：分离、纯化和测量酶的本质是为了得到高纯度、活性较高的脂肪酶产品。
3. 研究进展（1）发酵条件的优化脂肪酶活性的提高对生产工艺的产率和经济效益都有着重要的意义。
为此，研究者通过对发酵温度、pH值、氮源等条件进行优化，成功提高了脂肪酶的产量和酶活。
例如，Jamil Khaskheli等发现，酵母菌Candida rugosa生产脂肪酶的酶活性受到温度影响较大，并在32℃的条件下达到最大值。
（2）遗传工程改造遗传工程技术在脂肪酶生产领域也已经得到广泛应用。
相关研究表明，基于DNA重组技术可以对脂肪酶的生产菌株进行改造，提高酶的稳定性和催化效率。
例如，一项由瑞典Karolinska Institute的研究人员完成的研究表明，通过在大肠杆菌中表达脂肪酶基因，可以显著提高脂肪酶的产量和催化效率。
（3）新型菌株的筛选与发现是时候采用新型菌株用于脂肪酶生产。
脂肪酶的微生物生产技术综述(优选参考)
脂肪酶的微生物生产技术综述By 夏远川脂肪酶是一种普遍存在于动植物和微生物体内的酶，也是最早研究的酶类之一，早在1834年就有关于兔胰腺脂肪酶活性的报道。
[1]脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，一般用于催化水解和合成反应，在油水界面上，它催化三酰甘油的酯键的水解，生成甘油一酯、甘油二酯或直接生成甘油和脂肪酸。
[2]脂肪酶还可催化酯类化合物的醇解、酯化、酯交换等反应，且不需要辅酶，在工业生产和研究工作中均有广泛应用。
[3]脂肪酶按作用时的适应温度可分为高温脂肪酶、中温脂肪酶、低温脂肪酶；按适宜pH可分为碱性脂肪酶、中性脂肪酶、酸性脂肪酶。
脂肪酶的主要工业应用方向：1、洗涤工业：在洗涤剂中添加脂肪酶可使洗涤剂对脂质类污渍的去除效果大大提高，并可减少表面活性剂及无机助剂（尤其是三聚磷酸钠）的用量，大大减少洗涤剂带来的环境污染。
用于洗涤剂的脂肪酶为碱性脂肪酶，在碱性范围内有活性、活性不受表面活性剂影响、对氧系漂白剂稳定、热稳定性好，并且由于大多数加酶洗涤剂都适当配有蛋白酶，因此用于洗涤剂的脂肪酶还应具抗蛋白酶降解的能力。
[4]1988年，丹麦NOVO公司将碱性脂肪酶应用于洗涤剂中并推向市场。
1992年，这家公司构建了商业上第一株产脂肪酶菌株。
[1]2、食品工业：油脂改性是食品加工过程中的一个重要环节，脂肪酶可通过催化酯交换、酯转移、水解等反应，改变油脂的的物理化学性质，使便宜的、营养价值低的油脂升级为昂贵的、营养价值高的油脂；此外脂肪酶还可用于合成广泛应用于食品工业的糖酯类产品、合成不带副产物或毒性物质的芳香味酯类化合物、合成抗坏血酸酯类抗氧化剂如异抗坏血酸等。
[5]3、造纸工业：使用脂肪酶处理纸浆可减少胶黏物（绝大多数胶黏物都含有大量酯键）对造纸毛毯网间空隙的堵塞，提高纸机的运行效率和成纸品质，并降低环境污染，减少废水处理的负荷。
此外脂肪酶脱墨技术在废纸利用方面也起到非常大的作用，与传统脱墨技术相比脱墨效果更好环境污染更低，具有很大的优势。
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微生物脂肪酶的纯化方法概述
摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术
1.脂肪酶概述
脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质
在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶
中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物
微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有许多优点:(一)微生物脂肪酶种类多、来源广、生长周期短；(二)具有比动植物脂肪酶更广的pH和作用温度适应范围以及更广的底物适应类型；(三)微生物脂肪酶便于进行工业化生产，同时容易制取高纯度制剂。
目前，工业生产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉以及假单胞菌等。
1.3产脂肪酶微生物的育种
在生产实践中，提高微生物产脂肪酶能力的方法可采用传统诱导和现代基因工程两种方法进行微生物育种，从根本上改变微生物的产酶特性，从而获得稳定高产的工程生产菌株。
(1)传统诱变法
虽然现代基因工程技术在微生物育种中已经有了相当的发展，但由于传统诱变技术具有操作简单快速、成本低和结果稳定有效等优点，目前仍然广泛用于微生物菌种的选育。
(2)基因工程法
传统诱变法虽然是一种操作简单、技术成熟的好方法，但比起现代基因工程法，在微生物的育种中存在一定的局限，难以获得突破性进展。
随着生物科技的不断进步，基因工程法用于产脂肪酶微生物的育种技术正逐渐成熟并己经用于研究和生产实践。
目前，基因工程在产脂肪酶细菌育种中的应用主要是通过克隆相应的脂肪酶基因，然后在异源宿主菌中实现大量表达。
常用的异源宿主主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和曲霉表达系统三种。
其中曲霉表达系统由于其强大的分泌能力和成熟的发酵技术而得到生产者的青睐，并成功地用于生产实践。
1987年诺维信公司将克隆的柔毛腐质霉脂肪酶基因在曲霉菌中大量表达，其产量提高了1000倍，该公司销。