脂肪酶的概述及应用
脂肪酶与高血压三项的临床应用
口服避孕药和激素替代疗法( HRT) 状态。
肾素检测的临床意义：
①：应用于诊断由于肾动脉狭窄导致的高血压或肾血 管性高血压，大约10%的成年人存在高血压的症状， 肾动脉狭窄是一部分高血压病人的主要病因。 ②：帮助临床医生决定是否进行肾血管的影像学研究 。 ③：对于诊断原发性醛固酮增多症具有重要的意义。 ④：能够为原发性高血压病人心血管系统的并发症的 发生提供有效的信息。 对于一些肾上腺功能低下并采用类固醇激素替代治疗 的病人，当治疗效果充足时，肾素水平正常，当治疗 效果不足时，肾素水平过高。
其它疾病：酗酒、酒精性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺 癌、肝胆疾患、慢性肾病等血清LPS可有不同程度的升 高。
降低见于胰腺炎晚期、胰大部切除患者。
血清LPS可与科室其它指标联合检测：
?血清LPS与血AMY联合检测可以提高AP诊断的阳性率，尤 其是可以提高疑似AP的诊断的敏感性；
? 血清LPS 与C-反应蛋白联合检测可作为AP病情诊断和治疗 过程中评估病情变化的重要实验室指标；
影响ARR 药物
不影响ARR 的药物
螺内酯、依普利酮、阿米洛利及 氨苯喋啶; 排钾性利尿剂; 来源于 甘草的产品( 如甘草类糖果，嚼用
烟草) 。建议至少停药4周。
如维拉帕米缓释剂、肼苯哒嗪 ( 合用维拉帕米缓释剂，避免反 射性心动过速) 、哌唑嗪、多沙 唑嗪、特拉唑嗪等
β 肾上腺素能阻断剂、中枢α2激 动剂( 如可乐定和α 甲基多巴) 、 非甾体类抗炎药; 血管紧张素转换
版）》将高血压定义为：在未使用降压药物的情况下，非同 日3次测量血压，收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg。 收缩压≥140mmHg和舒张压? 90mmHg为单纯性收缩期高血 压。患者既往有高血压史，目前正在使用降压药物，血压虽 然低于140/90mmHg，也诊断为高血压。
脂肪酶底物合成-概述说明以及解释
脂肪酶底物合成-概述说明以及解释1.引言1.1 概述脂肪酶底物合成是一项重要的研究领域，涉及到有机化学、生物化学和生物工程等多个学科的知识。
脂肪酶是一类催化脂肪酸酯水解反应的酶，广泛存在于生物体内。
脂肪酶底物合成研究的主要目的是合成和优化脂肪酶的底物，以实现对酶的作用机理和底物特征的深入了解，同时也为相关领域的应用研究提供基础。
脂肪酶底物合成具有重要的科学意义和应用价值。
首先，通过合成不同结构的脂肪酶底物，可以研究酶的催化机制和结构-活性关系。
这对于深入了解脂肪酶的催化原理、酶活性调控以及酶底物的结构要求具有重要的启示作用。
其次，脂肪酶底物合成也为开发新型酶抑制剂和活性探针提供了重要途径。
通过设计和合成具有特定结构的底物，可以筛选和发现针对特定脂肪酶的高效抑制剂，为相关疾病的治疗提供新思路和新药物开发的基础。
此外，脂肪酶底物合成还与高效能源转化、生物燃料合成等领域有着密切的联系，为可持续能源开发和利用提供了有益的支持。
未来发展方向上，脂肪酶底物合成仍面临一些挑战。
首先，需要进一步提升合成方法的效率和底物的多样性，以满足不同研究需求的底物要求。
其次，研究人员还需要加深对脂肪酶催化机制的理解，通过合成具有结构多样性的底物，揭示底物与酶的相互作用和识别机制，为深入探索脂肪酶底物合成的相关问题提供更好的基础支撑。
最后，需要加强与其他学科的交叉研究，如有机合成、生物学和计算化学等，以推动脂肪酶底物合成研究的发展，并为其在生物医学领域的应用和推广提供更多的创新思路和技术手段。
综上所述，脂肪酶底物合成是一个具有重要意义和广阔前景的研究领域。
通过深入研究脂肪酶的催化机制和底物合成特征，我们可以更好地理解脂肪酶的功能和应用。
未来随着研究技术的不断进步和相关学科的融合，相信脂肪酶底物合成在生物医学领域的应用前景将会更加广阔。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的内容主要介绍整篇文章的组织结构和每个章节的主要内容。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。
脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。
为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。
本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。
2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。
脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。
脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。
3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。
下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。
3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。
3.反应一段时间后停止反应。
4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。
•优点：方法简单、成本低廉。
•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。
3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。
3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、灵敏度较高。
•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。
3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。
2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。
3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、实时监测。
•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。
3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。
脂肪酶及其在化学品合成中的应用
脂肪酶及其在化学品合成中的应用1. 引言1.1 脂肪酶的概述脂肪酶，也称为脂肪水解酶或脂肪酯酶，是一类能够催化脂肪酯水解生成脂肪酸和甘油的酶类。
在生物体内，脂肪酶起着重要的作用，参与脂肪的消化和代谢过程。
脂肪酶具有高度的底物特异性和催化活性，能够高效地水解各种类型的脂肪酯。
脂肪酶在各种生物体中都广泛存在，包括微生物、植物和动物等。
不同来源的脂肪酶在结构和催化机制上可能存在一定差异，但它们在水解脂肪酯方面的功能是相似的。
脂肪酶的活性受到pH值、温度、离子浓度等环境因素的影响，因此在应用中需要考虑到这些因素对其活性的影响。
除了在生物体内的代谢过程中，脂肪酶在化学品合成中也具有重要的应用价值。
通过利用脂肪酶的催化作用，可以高效合成各种酯类化合物，包括甘油酯、脂肪酯等。
脂肪酶催化合成具有优异的底物特异性和产物选择性，能够在不同条件下实现高产率和高纯度的产物制备。
在化学品生产和合成领域，脂肪酶被广泛应用，并在可持续化学品合成和绿色合成化学品中展示出巨大的潜力。
1.2 脂肪酶在化学品合成中的重要性在化学品合成领域，脂肪酶具有重要的作用。
脂肪酶是一类能够催化脂肪水解反应的酶类蛋白，是生物体内重要的消化酶之一。
在化学品合成中，脂肪酶可以作为催化剂，促进酯类化合物的合成反应。
由于脂肪酶具有高效、特异性强、对底物选择性广泛等优点，使其在化学品合成中备受青睐。
脂肪酶在化学品合成中的重要性不容忽视，其在催化反应中的性能优势为化学品合成领域带来了新的发展机遇，也为绿色化学品生产提供了重要的技术支持。
随着对脂肪酶研究的不断深入和技术的不断完善，脂肪酶在化学品合成中的应用前景将更加广阔，为可持续发展和绿色化学品生产做出更大的贡献。
2. 正文2.1 脂肪酶在合成酯类化合物中的应用脂肪酶在合成酯类化合物中起着重要作用。
酯类化合物是一类广泛存在于生活中的化合物，包括酯类香精、酯类溶剂、酯类润滑剂等。
脂肪酶通过催化酯化反应，可以有效地合成各种酯类化合物。
脂肪酶溶于水-概述说明以及解释
脂肪酶溶于水-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述脂肪酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。
它能催化脂肪的水解反应，将脂肪分解成脂肪酸和甘油。
在工业上，脂肪酶也被广泛应用于食品加工、洗涤剂制造以及环境保护等领域。
然而，在传统观念里，脂肪酶常常被认为是在油脂中活动的酶类。
然而，最近的研究发现，脂肪酶实际上也能在水中进行活动。
这一发现引起了科学界的广泛关注，并引发了对脂肪酶在水中溶解性的研究。
了解脂肪酶在水中溶解性的特性对于更好地理解其催化机制以及应用的拓展具有重要意义。
本文将对脂肪酶的特性和在水中的溶解性进行详细探讨。
首先，将介绍脂肪酶的基本特性，包括其化学结构、催化机制等方面。
然后，将重点研究脂肪酶在水中的溶解性。
通过对其在水中的溶解行为的研究，有助于揭示脂肪酶与水分子之间的相互作用关系以及其在水中的催化效果。
最后，通过实验和数据分析得出结论，总结脂肪酶溶于水的特点以及可能的应用领域。
通过本文的研究，我们有望进一步了解脂肪酶的催化机制和溶解性特性，为其应用的开发和改进提供理论基础。
这将有助于推动脂肪酶在工业上的广泛应用，并为相关领域的研究提供新思路和方向。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分旨在介绍整篇文章的组织和内容安排。
本文共分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要有三个子部分：概述、文章结构和目的。
概述部分简要介绍了脂肪酶溶于水这个话题的背景和重要性。
可以提到脂肪酶在生物化学、食品科学和医学等领域的应用，并简述脂肪酶溶解性的研究现状。
文章结构部分则详细说明了本文的组织框架。
文章采用大纲结构，共分为两个主要部分——正文和结论。
正文包括脂肪酶的特性和脂肪酶在水中的溶解性的内容。
结论部分则总结了整篇文章的主要观点和结果。
目的部分明确了本文的写作目的。
可以指出研究脂肪酶在水中的溶解性的重要性和意义，以及本文的研究目标和期望的成果。
在整体上，本文的结构清晰明了，逻辑严谨。
脂肪酶_酶比色法_概述说明以及解释
脂肪酶酶比色法概述说明以及解释1. 引言1.1 概述脂肪酶是一类具有催化作用的酶，在生物体内起着关键的功能。
它们能够加速脂肪分子（甘油三酯和脂肪酸）的降解，从而促进脂肪代谢和能量释放。
随着对脂肪酶及其应用领域的研究不断深入，人们发现了许多检测和分析脂肪酶活性的方法，其中酶比色法是一种被广泛应用的方法。
1.2 文章结构本文将对脂肪酶和酶比色法进行详细描述和解释。
首先，在“引言”部分，我们将给出本文的背景和目标，并简要概述脂肪酶以及酶比色法的重要性。
接下来，将在“脂肪酶”部分介绍其定义、分类、生物学功能以及应用领域。
紧接着，在“酶比色法”部分将详细讲解该方法的定义、原理、应用和优势，同时还会列举实验流程和步骤。
然后，在“概述说明脂肪酶的工作机制”部分，将探讨脂肪酶的作用方式、反应条件和影响因素，并通过实例及实验结果解读进一步阐述。
最后，在“结论”部分，将对本文的主要观点和发现进行总结，并展望和建议未来关于脂肪酶研究的方向。
1.3 目的本文的主要目的是深入介绍脂肪酶和酶比色法，以提供关于脂肪酶工作机制及其检测方法方面的详尽信息。
通过对脂肪酶概念、分类、生物学功能以及应用领域进行说明，读者能够全面了解脂肪酶在生物体内的重要性。
此外，详细介绍酶比色法的定义、原理、应用、优势以及实验流程和步骤，有助于读者更好地理解该方法在测定脂肪酶活性方面的价值。
最后，通过概述脂肪酶的工作机制并解读相关实验结果，读者将深入了解脂肪酶催化过程中的关键步骤和条件。
希望本文能为研究人员提供有价值的信息，并对脂肪酶的研究和应用提供启示和指导。
2. 脂肪酶:2.1 定义和分类:脂肪酶，也称为脂肪水解酶，是一类能够催化脂肪分子水解反应的酶。
它们能够将复杂的脂肪分子分解成较小的脂肪酸和甘油。
根据其作用方式和底物特点，脂肪酶可以被分为三大类：lipase、esterase和phospholipase。
- lipase（脂肪解酶）：主要催化三酰甘油水解反应，将三酰甘油分解成甘油和游离脂肪酸。
脂肪酶活力测定方法及其比较
脂肪酶活力测定方法及其比较一、本文概述脂肪酶是一类能够催化脂肪酸酯水解的酶类，广泛存在于动物、植物和微生物中，其在生物体内起着重要的代谢作用。
脂肪酶活力测定方法的研究对于了解脂肪酶的催化性质、生物合成、调控机制以及在工业、医药和农业等领域的应用具有重要意义。
本文旨在介绍常见的脂肪酶活力测定方法，包括滴定法、比色法、荧光法、高效液相色谱法等，并比较它们的优缺点，以期为读者提供一个全面、系统的脂肪酶活力测定方法参考。
通过本文的阐述，读者可以了解各种测定方法的基本原理、操作步骤、适用范围以及注意事项，从而根据自身研究需求选择最合适的测定方法。
本文还将探讨脂肪酶活力测定方法的未来发展趋势，以期为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
二、脂肪酶活力测定的基本原理脂肪酶活力测定主要基于脂肪酶水解脂肪酸的特性，通过测量水解产物的生成速率来评估酶的活性。
脂肪酶是一种能够催化脂肪酸酯水解的酶，其催化反应可以表述为：脂肪酶 + 脂肪酸酯→脂肪酸 + 醇。
在测定脂肪酶活力时，通常使用特定的底物，如三乙酸甘油酯（p-nitrophenyl butyrate）或橄榄油等，这些底物在脂肪酶的作用下会水解生成相应的脂肪酸和醇。
在测定过程中，通常使用比色法、滴定法或高效液相色谱法等方法来检测水解产物的生成量。
例如，当使用p-nitrophenyl butyrate 作为底物时，水解产生的p-nitrophenol在碱性条件下会呈现黄色，其颜色深浅与浓度成正比，因此可以通过比色法来测定其浓度，从而推算出脂肪酶的活力。
不同的测定方法具有各自的优缺点，比如比色法操作简便，但可能受到颜色干扰和pH值变化的影响；滴定法则需要精确的化学计量和反应条件控制；高效液相色谱法则具有更高的灵敏度和准确性，但设备成本较高，操作相对复杂。
因此，在选择脂肪酶活力测定方法时，需要根据实验条件和目的来综合考虑各种因素。
脂肪酶活力测定的结果还受到多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、反应温度、pH值等。
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脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。
脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan等）。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。
酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。
不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。
其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。
脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。
酶是一种活性蛋白质。
因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。
已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。
脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。
水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。
二脂肪酶的结构解析1、分子结构研究表明, 来源不同的脂肪酶 ,其氨基酸组成数目从 270 ～ 641 不等 , 其分子量为29 000～ 100 000。
迄今为止 ,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达 , 并利用 X-衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组(triad)结构。
表1列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。
正如下表所示, 多数酶都有变种(如 CCL(A)和CCL(B)、GCL Ⅰ和 GCL Ⅱ等),不过这些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列, 其氨基酸组成数目完全相同, 不同的只是个别氨基酸的差异。
一般而言, 不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同 , 而且位置不变;其分子量和等电点略有不同。
2、脂肪酶催化中心三元组研究表明，尽管不同来源的脂肪酶有不同的氨基酸组成(残基数目、分子量、三维空间结构等),但由于生物的同源性和进化过程的保守性 ,其催化中心拥有相似或相同的特征区 His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W 、X、Y、Z 指非特异性氨基酸)。
如图1所示，绝大多数脂肪酶的活性中心都由 Ser 和His 参与组成, His、Ser与另一种氨基酸残基(如 CCL 和 GCL的Glu、RML 和hPL 的 Asp 等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组(triad)。
如图 2 所示3、立体结构具体参数方法：三．脂肪酶的纯化与表达pPIC9k- mRCL 表达质粒的构建1.以华根霉基因组DNA为模板使用PCR方法扩增RCL（华根霉脂肪酶全基因）成熟肽，扩增的基因片段纯化后克隆到载体 pMD19-T Vector 中，转化E.coli.DH5α及进行重组质粒的筛选，由此构建重组质粒 pMD19-mRCL 。
2.由质粒 pMD19-mRCL切下目的基因片段，连入表达载体 pPIC9k 构建表达质粒 pPIC9k-mRCL 。
（1）质粒双酶切克隆的质粒 pMD19-mRCL 和酵母表达质粒 pPIC9k 分别被 AvrⅡ和Not I 双酶切，得到pMD19-mRCL质粒双酶切的 800bb 左右的小片段以及 pPIC9k 质粒的双酶切线性质粒大片段，回收目的条带。
（2）连接载体 DNA 与目的 DNA 片段混合连接。
（3）转化 E.coli.DH5α及重组质粒的筛选重组质粒pPIC9K-mRCL的构建重组蛋白在巴斯德毕赤酵母 GS115 中的初步表达1. 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备2. 巴斯德毕赤酵母的电转化对质粒线性化，回收酶切产物；再与巴斯德毕赤酵母感受态细胞混匀，电转化得到含目的基因的重组巴斯德毕赤酵母3. 重组巴斯德毕赤酵母的鉴定可用浓度梯度进行抗性筛选4. 巴斯德毕赤酵母表达脂肪酶甲醇诱导重组蛋白的表达巴斯德毕赤酵母表达系统的优点（选择的原因）：1.毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低4.表达后的纯化步骤：●对象:重组巴斯德毕赤酵母●过程：1.摇瓶甲醇诱导培养2.脂肪酶的分离纯化（1）10 KD 超滤膜浓缩将mRCL发酵液离心后弃掉沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，微滤后的溶液用10 KD 超滤膜浓缩。
浓缩酶液用缓冲液透析过夜。
（2）强阳离子交换柱层析将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的强阳离子交换柱层析（Ф1.6cm×20cm），用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。
后用NaCl浓度梯度缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，用缓冲液透析。
3）疏水色谱柱层析将透析后的酶液继续用疏水柱层析(Ф1.6 cm×20 cm)层析，用相同缓冲液洗脱除去未吸附蛋白。
然后用硫酸铵浓度梯度差缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，最后用 H2O 洗脱，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，透析除盐。
4）得到脂肪酶活性组分mRCL四．脂肪酶的化学修饰设计思路脂肪酶作为一种水解酶，不仅催化水解反应而且催化有机相中酯合成和酯交换反应。
有机相酶催化技术自 20 世纪 80 年代开创以来，已获得了巨大的发展，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。
近几年来人们为了提高酶在有机相中的溶解性及稳定性，在酶的化学手段修饰和生物学手段修饰方面开展了许多工作[1－6]。
而化学修饰是提高和改变酶催化性能的有效方法。
Basri 等[7]用氨基酯的盐酸盐对脂肪酶进行化学修饰，发现修饰酶在有机溶剂中的溶解度、热稳定性和催化酯化反应活性都有很大提高。
Tatsuo Maruyama 等[8]用硬脂酸修饰了脂肪酶，发现虽然水解活性下降，但酯化活性明显提高。
从文献来看，就化学修饰改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修饰酶在有机相（均相）中的稳定性、催化活性等问题，而涉及非均相界面催化的研究甚少。
表面活性剂是一类兼具亲油基和亲水基的两亲物质，它能富集于界面从而显著地改变界面性质。
当水溶性的酶分子中引入长链烷基后，便具有了类似于表面活性剂的两亲结构。
因此与未经修饰的酶相比，修饰后的酶疏水性增强，界面活性提高，从而有利于在有机相或界面催化化学反应，这对于酶的实际应用具有重要意义。
本文从界面化学的角度对用 N-羟基琥珀酰亚胺活化的硬脂酸修饰的 Lipolase 脂肪酶的界面化学性质进行了研究，重点考察了修饰酶降低表/界面张力的能力及界面催化活性。
1实验材料与方法1.1化学试剂及仪器化学试剂：Lipolase 100L，诺维信（中国）生物技术有限公司生产；N-羟基琥珀酰亚胺，为生化试剂；硬脂酸及其他试剂，为国产分析纯试剂，购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。
仪器：冷冻干燥仪（7934001 8917z-01，USA），紫外可见分光光度计(UVIKON，Germany)，元素分析仪（Vario EL，Germany），表面张力仪（DCA315，USA)，界面张力仪（DVT30，Germany）及 LB 成膜装置 LB5000（KSV5000，Finland)。
1.2硬脂酸琥珀酰亚胺酯的制备活化后的硬脂酸易于与酶表面的氨基反应，因此先将硬脂酸活化。
将硬脂酸溶入适量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入一定比例的N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳酰亚胺。
三者摩尔比为1∶2.25∶2.25[9－10]。
磁力搅拌反应 8 h，反应温度为 30 ℃。
反应结束后过滤，滤液用乙醚萃取。
蒸去乙醚得到白色固体，然后用无水乙醇反复洗涤后经真空干燥即得。
1.3Lipolase 脂肪酶的化学修饰在磁力搅拌下，将 Lipolase 100 L 用透析袋于去离子水中透析 2 天，冷冻干燥得到白色固体酶晶体。
固体酶置于 5 ℃冰箱中储存备用。
300 mg 固体酶溶于 20 mL 磷酸二氢钾–硼砂缓冲液（pH=7.4），将 200 mg 硬脂酸琥珀酰亚胺酯溶于 5 mL DMF 后逐滴加入酶溶液。
10 ℃下反应 10 h。