脂肪酶的概述与应用
脂肪分解 脂肪酶
脂肪分解脂肪酶脂肪分解：脂肪酶脂肪是我们身体中常见的一种能量储备物质，它主要存在于脂肪细胞中。
当我们需要能量时，脂肪就会被分解成脂肪酸和甘油，然后通过新陈代谢进入我们的血液，提供能量供给。
这个过程中，脂肪酶发挥着重要的作用。
脂肪酶是一种催化脂肪分解的酶类，也称为脂解酶。
它存在于我们的胰液和肠液中，主要由胰腺和肠道分泌。
脂肪酶通过催化脂肪分子的水解反应，将脂肪分解成脂肪酸和甘油。
这一反应的结果是，脂肪酸和甘油可以被吸收和利用，提供给身体所需的能量。
脂肪酶在脂肪分解过程中起到至关重要的作用。
首先，脂肪酶能够降低脂肪分子的活化能，使其更容易发生水解反应。
这意味着，脂肪酶可以加速脂肪分解的速度，提高能量供给的效率。
脂肪酶具有特异性，只能催化特定类型的脂肪分子。
不同类型的脂肪分子在结构上存在差异，因此需要特定的脂肪酶来催化其分解。
这种特异性保证了脂肪酶只会催化特定的脂肪分子，不会对其他分子产生影响，从而保证了分解过程的精确性和高效性。
脂肪酶还具有高度的稳定性。
它能够在不同的环境条件下维持其催化活性，如不同的温度、酸碱度等。
这使得脂肪酶能够在胰液和肠液等不同的消化液中正常发挥作用，确保脂肪的有效分解和吸收。
脂肪酶的催化作用是一个复杂的过程，涉及到多个步骤和多种分子间的相互作用。
首先，脂肪酶与脂肪分子结合，形成一个酶-底物复合物。
然后，酶通过催化作用降低脂肪分子的活化能，使其发生水解反应。
最后，脂肪分子被分解成脂肪酸和甘油，从而完成脂肪的分解过程。
脂肪酶的催化作用不仅发生在人体内，还广泛存在于其他生物中。
例如，某些微生物和真菌也能产生脂肪酶，用于分解环境中的脂肪物质。
这些脂肪酶在环境中的分解作用对于生态系统的平衡和物质循环具有重要意义。
脂肪酶是一种催化脂肪分解的酶类，它通过降低脂肪分子的活化能，加速脂肪分解的速度。
脂肪酶具有特异性和稳定性，能够精确催化特定类型的脂肪分子，确保分解过程的高效进行。
脂肪酶的催化作用在人体内起着重要作用，为我们提供能量供给。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
脂肪酶催化三联体
脂肪酶催化三联体
《脂肪酶催化三联体》
一、概述
脂肪酶催化三联体是一种有效的降解脂肪的方法，它可以让饮食中摄入的脂肪更有效地分解利用。
脂肪酶催化的三联体由三种不同功能的酶组成：细胞色素P450（CYP）、乙酰辅酶A（CoA）和磷脂酰乙烯酰甘油酯酶（lipase）。
这三种酶根据其功能作用而有所不同，但在整个脂肪催化三联体中的联合能够共同作用，达到脂肪高效的分解。
二、细胞色素P450
细胞色素P450（CYP）是一种体内存在的蛋白质，主要负责酶分解过程的第一步，也就是将脂肪酸变成氧化产物。
它与乙酰辅酶A（CoA）和磷脂酰乙烯酰甘油酯酶（lipase）结合，可以在体内实现生物氧化作用。
三、乙酰辅酶A
乙酰辅酶A（CoA）参与了脂肪酸的氧化脱氢和分解，将脂肪酸氧化分解为乙酰腰碳酸（acetyl-CoA），并在体内特定的反应中起着关键的作用。
当乙酰辅酶A结合细胞色素P450（CYP）和磷脂酰乙烯酰甘油酯酶（lipase）时，能够极大地提高酶的分解速度，有效地分解脂肪。
四、磷脂酰乙烯酰甘油酯酶
磷脂酰乙烯酰甘油酯酶（lipase）是脂肪酶催化三联体中第三
种酶，参与了脂肪分解的最后一步，将乙酰腰碳酸分解为二酰基腰碳酸和甘油，其中甘油可以被体内的糖酵解酶分解，而二酰基腰碳酸可以被某些酶分解为乙醇胺和乙酸，而这些物质最终被体内的酶分解为二氧化碳和水，从而实现可持续的饮食营养和能量管理。
五、结论
脂肪酶催化三联体是一种高效的降解脂肪的方法，它能有效地将脂肪分解成可利用的氧化产物，并将其有效地分解为二氧化碳和水等可利用的物质，从而实现可持续的饮食营养和能量管理，这是一种现代的有效的脂肪摄入控制方法。
溶酶体酸脂肪酶__解释说明以及概述
溶酶体酸脂肪酶解释说明以及概述1. 引言1.1 概述溶酶体酸脂肪酶是一种位于细胞溶酶体内的重要酵素，其功能是参与脂质代谢和调节细胞内脂质平衡。
它在细胞内分解脂肪酯、磷脂和胆固醇等复杂的脂质物质，从而提供能量和构建细胞结构所需的原料。
1.2 文章结构本文将分为五个部分对溶酶体酸脂肪酶进行详细论述。
首先，在引言部分中，我们将概述溶酶体酸脂肪酶的重要性，并介绍整篇文章的结构和目的。
接下来，在第二部分中，我们将详细阐述溶酶体酸脂肪酶的定义、命名以及其在细胞内的功能。
第三部分将探讨这一酵素的调控机制，包括转录调控、蛋白质翻译后修饰调控以及底物与阻遏调节。
在第四部分中，我们将介绍溶酶体酸脂肪酶在疾病中的作用和重要性，涵盖遗传缺陷引起的溶酶体酸脂肪酶缺乏症、溶酶体膜损害导致的功能异常以及免疫系统异常相关的溶酶体受损和功能紊乱。
最后，在结论部分，我们将对全文进行总结，并展望溶酶体酸脂肪酶领域未来的研究方向。
1.3 目的本文旨在全面介绍溶酶体酸脂肪酶的定义、功能、调控机制以及其在疾病中的作用和重要性。
通过对这一主题的深入讨论，我们希望加深对溶酶体酸脂肪酶的认识，为进一步研究和治疗相关疾病提供理论基础和指导。
2. 溶酶体酸脂肪酶的定义与功能2.1 定义与命名溶酶体酸脂肪酶是一种存在于细胞内溶酶体中的水解酶，它主要负责分解和降解细胞内的脂质物质。
这种酸性脂肪酶通常由LAL基因编码，并被称为LAL （Lysosomal Acid Lipase）。
2.2 结构和组成溶酶体酸脂肪酶是一种单链糖蛋白，在细胞中主要以泡沫样形态存在。
其表面覆盖有多个糖基化残基，其中一些糖基化残基与该酵素的稳定性和活性密切相关。
此外，溶酶体脂肪酶还含有多个功能域，如催化区、保守的C端序列以及低密度脂质受体结合区等。
2.3 功能与生理作用溶酶体酸脂肪酶在细胞内扮演着重要角色，具有以下功能和生理作用：1) 降解祖细胞内源性和摄入来源的脂质物质：溶酶体酸脂肪酶通过水解三酰甘油、胆固醇酯和其他脂类化合物，将其分解为游离脂肪酸和其他代谢产物。
脂肪酶的生物学改造
脂肪酶的生物学改造叶纯1，2，王玉娟1*（1.中国科学院合肥物质科学研究院强磁场中心，合肥 230031；2.中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230036）摘要：脂肪酶作为重要的生物催化剂，由于其反应条件温和、绿色环保被广泛应用于能源、食品、生物医药等领域，但适用于大型工业生产的经济型脂肪酶仍然有限，如何改造、开发出更多适用于工业生产中的理想型脂肪酶成为近年来研究热点。
综述了脂肪酶结构、催化机理，以及近年来脂肪酶改造的相关技术。
以期给相关科研工作者的未来研究工作以启发。
关键字：油脂；脂肪酶；改造；生物技术The biological modification of lipases and its applicationin oil industryYE Chun1,2,WANG Yujuan1*(1. High Magnetic Field Laboratory, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China; 2.School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China.) 随着绿色工业概念的提出，以酶作为催化剂的生物催化以其底物的高度选择性、专一性以及产物环境友好型的特点，逐渐成为工业生产中被广泛应用的催化手段。
脂肪酶是工业生产中重要的酶制剂[1]，具有催化特异性高、反应条件温和、副产物少以及环境友好等特点，被广泛应用于工业生产中，但是脂肪酶制剂造价高、酶与底物难分离、多余游离脂肪酶难回收等问题制约了天然脂肪酶的工业应用。
近年来，大量研究致力于对脂肪酶进行改造，生物技术的飞速发展更为为改造出更多适用于工业生产的理想脂肪酶制剂提供了有利的技术支持。
本文将综述脂肪酶的结构、催化机理及利用生物学技术对其进行改造的研究现状，对比各种技术优缺点。
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达
产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达产脂肪酶微生物的筛选及脂肪酶基因的克隆表达摘要：脂肪酶是一类催化脂肪水解的酶，广泛应用于食品、制药和生物工程等领域。
本文旨在概述产脂肪酶微生物的筛选方法以及如何克隆和表达脂肪酶基因。
通过筛选出高产脂肪酶的微生物，并利用基因克隆技术将其基因表达，可以为大规模生产纯脂肪酶提供基础。
1. 引言脂肪酶是一种催化脂质的水解反应酶，广泛存在于微生物中。
它们通过将脂肪酯水解为脂肪酸和甘油，起到重要的催化作用。
因此，寻找高产脂肪酶的微生物，并将其脂肪酶基因克隆和表达，具有重要的应用价值。
2. 产脂肪酶微生物的筛选产脂肪酶的微生物广泛存在于土壤、水体和动物消化系统等环境中。
筛选产脂肪酶微生物的方法主要有：直接筛选法、改进筛选法和基因工程筛选法。
2.1 直接筛选法直接筛选法是最常见也是最简单直接的方法之一。
通过将微生物菌株进行培养，然后检测菌液中产酶能力。
其中，利用酶抑制剂和显色剂的方法可以进行定性和定量的检测。
该方法的优点是操作简便，易于操作。
2.2 改进筛选法改进筛选法通过加入酶诱导剂、化合物诱导剂和高浓度含油样品等方式，提高产脂肪酶的微生物菌株筛选效果。
例如，可使用大豆油、浓缩桔子油等作为诱导剂，增强菌株胞外酶的产酶能力。
2.3 基因工程筛选法基因工程筛选法是利用基因工程技术构建含有脂肪酶基因的表达载体，转化到宿主菌株中，使其表达目标基因并产生脂肪酶。
这种方式可通过对基因进行改造和优化，提高脂肪酶活性和稳定性。
同时，基因工程筛选法还可以利用高通量筛选技术，如流式细胞术和高通量测序技术，提高筛选效率。
3. 脂肪酶基因的克隆和表达脂肪酶基因的克隆和表达是关键步骤，它们可以为脂肪酶的高效生产提供基础。
3.1 脂肪酶基因的克隆脂肪酶基因的克隆可以通过PCR扩增、限制性内切酶切割和连接等方法实现。
首先，从目标微生物的基因组DNA或环境DNA中提取目标基因的DNA序列。
然后，使用特异性引物进行PCR扩增，得到目标基因的DNA片段。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。
脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。
为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。
本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。
2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。
脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。
脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。
3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。
下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。
3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。
3.反应一段时间后停止反应。
4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。
•优点：方法简单、成本低廉。
•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。
3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。
3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、灵敏度较高。
•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。
3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。
2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。
3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、实时监测。
•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。
3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。
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脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。
脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。
脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veeraragavan 等）。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv 就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。
酯酶（EC3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（≤C8）形成的酯。
脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。
不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。
其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。
脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。
酶是一种活性蛋白质。
因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。
已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。
脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。
水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。
二脂肪酶的结构解析1、分子结构研究表明, 来源不同的脂肪酶 ,其氨基酸组成数目从 270 ～ 641 不等 , 其分子量为29 000～ 100 000。
迄今为止 ,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达 , 并利用 X-衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数, 确定了组成脂肪酶活性中心的三元组(triad)结构。
表1列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。
正如下表所示, 多数酶都有变种(如 CCL(A)和CCL(B)、GCL Ⅰ和 GCL Ⅱ等),不过这些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列, 其氨基酸组成数目完全相同, 不同的只是个别氨基酸的差异。
一般而言, 不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同, 而且位置不变;其分子量和等电点略有不同。
2、脂肪酶催化中心三元组研究表明，尽管不同来源的脂肪酶有不同的氨基酸组成(残基数目、分子量、三维空间结构等),但由于生物的同源性和进化过程的保守性,其催化中心拥有相似或相同的特征区 His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W 、X、Y、Z 指非特异性氨基酸)。
如图1所示，绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser 和 His 参与组成, His、Ser与另一种氨基酸残基(如 CCL 和 GCL的Glu、RML 和 hPL 的 Asp 等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组(triad)。
如图 2 所示3、立体结构具体参数方法：三．脂肪酶的纯化与表达pPIC9k- mRCL 表达质粒的构建1.以华根霉基因组DNA为模板使用PCR方法扩增RCL（华根霉脂肪酶全基因）成熟肽，扩增的基因片段纯化后克隆到载体 pMD19-T Vector 中，转化E.coli.DH5α及进行重组质粒的筛选，由此构建重组质粒 pMD19-mRCL 。
2.由质粒 pMD19-mRCL切下目的基因片段，连入表达载体pPIC9k 构建表达质粒 pPIC9k-mRCL 。
（1）质粒双酶切克隆的质粒 pMD19-mRCL 和酵母表达质粒 pPIC9k 分别被 Avr Ⅱ和Not I 双酶切，得到pMD19-mRCL质粒双酶切的 800bb 左右的小片段以及 pPIC9k 质粒的双酶切线性质粒大片段，回收目的条带。
（2）连接载体 DNA 与目的 DNA 片段混合连接。
（3）转化 E.coli.DH5α及重组质粒的筛选重组质粒pPIC9K-mRCL的构建重组蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115 中的初步表达1.巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备2.巴斯德毕赤酵母的电转化对质粒线性化，回收酶切产物；再与巴斯德毕赤酵母感受态细胞混匀，电转化得到含目的基因的重组巴斯德毕赤酵母3.重组巴斯德毕赤酵母的鉴定可用浓度梯度进行抗性筛选4.巴斯德毕赤酵母表达脂肪酶甲醇诱导重组蛋白的表达巴斯德毕赤酵母表达系统的优点（选择的原因）：1.毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)基因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为8～14个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1，3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)，因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低4.表达后的纯化步骤：●对象:重组巴斯德毕赤酵母●过程：1.摇瓶甲醇诱导培养2.脂肪酶的分离纯化（1）10 KD 超滤膜浓缩将mRCL发酵液离心后弃掉沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，微滤后的溶液用10 KD 超滤膜浓缩。
浓缩酶液用缓冲液透析过夜。
（2）强阳离子交换柱层析将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的强阳离子交换柱层析（Ф1.6cm×20cm），用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。
后用NaCl浓度梯度缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，用缓冲液透析。
3）疏水色谱柱层析将透析后的酶液继续用疏水柱层析(Ф1.6 cm×20 cm)层析，用相同缓冲液洗脱除去未吸附蛋白。
然后用硫酸铵浓度梯度差缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，最后用H2O 洗脱，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，透析除盐。
4）得到脂肪酶活性组分mRCL四．脂肪酶的化学修饰设计思路脂肪酶作为一种水解酶，不仅催化水解反应而且催化有机相中酯合成和酯交换反应。
有机相酶催化技术自 20 世纪 80 年代开创以来，已获得了巨大的发展，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。
近几年来人们为了提高酶在有机相中的溶解性及稳定性，在酶的化学手段修饰和生物学手段修饰方面开展了许多工作[1－6]。
而化学修饰是提高和改变酶催化性能的有效方法。
Basri 等[7]用氨基酯的盐酸盐对脂肪酶进行化学修饰，发现修饰酶在有机溶剂中的溶解度、热稳定性和催化酯化反应活性都有很大提高。
Tatsuo Maruyama 等[8]用硬脂酸修饰了脂肪酶，发现虽然水解活性下降，但酯化活性明显提高。
从文献来看，就化学修饰改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修饰酶在有机相（均相）中的稳定性、催化活性等问题，而涉及非均相界面催化的研究甚少。
表面活性剂是一类兼具亲油基和亲水基的两亲物质，它能富集于界面从而显著地改变界面性质。
修饰原理当水溶性的酶分子中引入长链烷基后，便具有了类似于表面活性剂的两亲结构。
因此与未经修饰的酶相比，修饰后的酶疏水性增强，界面活性提高，从而有利于在有机相或界面催化化学反应，这对于酶的实际应用具有重要意义。
本文从界面化学的角度对用 N-羟基琥珀酰亚胺活化的硬脂酸修饰的Lipolase 脂肪酶的界面化学性质进行了研究，重点考察了修饰酶降低表/界面张力的能力及界面催化活性。
1实验材料与方法1.1化学试剂及仪器化学试剂：Lipolase 100L，诺维信（中国）生物技术有限公司生产；N-羟基琥珀酰亚胺，为生化试剂；硬脂酸及其他试剂，为国产分析纯试剂，购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。
仪器：冷冻干燥仪（7934001 8917z-01，USA），紫外可见分光光度计(UVIKON，Germany)，元素分析仪（Vario EL，Germany），表面张力仪（DCA315，USA)，界面张力仪（DVT30，Germany）及LB 成膜装置LB5000（KSV5000，Finland)。
1.2硬脂酸琥珀酰亚胺酯的制备活化后的硬脂酸易于与酶表面的氨基反应，因此先将硬脂酸活化。
将硬脂酸溶入适量N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入一定比例的N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳酰亚胺。
三者摩尔比为1∶2.25∶2.25[9－10]。
磁力搅拌反应8 h，反应温度为30℃。
反应结束后过滤，滤液用乙醚萃取。
蒸去乙醚得到白色固体，然后用无水乙醇反复洗涤后经真空干燥即得。
1.3Lipolase 脂肪酶的化学修饰在磁力搅拌下，将Lipolase 100 L用透析袋于去离子水中透析2天，冷冻干燥得到白色固体酶晶体。
固体酶置于5℃冰箱中储存备用。
300 mg固体酶溶于20 mL磷酸二氢钾–硼砂缓冲液（pH=7.4），将200 mg 硬脂酸琥珀酰亚胺酯溶于5 mL DMF 后逐滴加入酶溶液。
10℃下反应10 h。
反应完毕后，混合物在 4 000 r/min下离心15 min除去未反应的酯，重复操作两次。