产脂肪酶的微生物研究进展
产脂肪酶细菌的筛选与鉴定 姓名：范丽萍 学号：0911040203 班级：生09级6班 前言 1.脂肪酶的简介 脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶u J。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。 2.微生物产脂肪酶的研究历程 脂肪酶是最早研究的酶类之一(见表1)。从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的酶已制成结晶。根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球、，粘质色杆菌等也得到高度提纯，并对它们的理化性质[1]开展进一步研究。早在60年代，假丝酵母[2]、曲霉、根霉等菌产生的脂肪酶相继在日本进入商品生产(见表2)。我国60年代也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candida lipolytica)AS2．1203并于1969年制成酶制剂供应市场。
表1 常见的产脂肪酶的徽生物 菌 名 黑曲霉 荧光假单胞菌 白地霉 无根根霉 毛霉 圆柱假丝酵母 巢子须霉 德氏根霉 多球菌 棉毛状酶 圆弧青霉 粘质色杆菌
表2 常见商品酶 enzyme abbreviation manufacturer Candida cylindraces CC Sigina,amano Aspergillus niger AN Amino,fluka Rhisopus delemar RD amano
就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物产脂肪酶方面还有很大的研究空间，本实验主要就是通过对微生物的培养，筛选出产脂肪酶活力高的细菌。 3.微生物产脂肪酶的用途 微生物脂肪酶的应用虽不如淀粉酶，蛋白酶广泛，但在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。比如脂肪酶食品的加工、乳制品的生产以及在食品添加剂的工业生产中都有着不可估量的价值[1]。又比如脂肪酶在纺织物的应用方面[2]也具有一定的贡献。 4.国内外微生物脂肪酶的最新研究进展[3] 微生物脂肪醇是一种重要的工业酶类，也是当前国内外研究的热点。 （1）在食品工业中的应用 脂肪酶现已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黄油的增香。因为奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物，因此，脂肪酶和蛋白酶被广泛地用于加快奶酪的熟化和香味的产生。用脂肪酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性[4]。除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精饮料的香味，如在酒精饮料的发酵过程中加入一定量的低温脂肪酶[5]，产品具有类似奶酪的香味。脂肪酶还用于无脂肪肉的生产，如在鱼加工过程中脂肪的去除是用脂肪酶来完成的。另外，在生面团中加入脂肪酶使三甘酯部分水解而增加单甘酯的含量可延缓腐败，单甘酯和双甘酯的形成也使蛋白的起泡性质得到改善[6]。 （2）环境治理方面的应用 每年由于各种原因排入海中的石油达200万t，如不及时处理，不仅会造成鱼类的大量死亡，而且石油中的有害物质也会通过食物链进人人体。人们用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石油，可以将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良的养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达到快速降解石油的目的。脂肪酶生物技术应用于被污染环境的修复以及废物处理是—个新兴的领域。石油开采和炼制过程中产生的油泄漏，脂加工过程中产生的含脂废物以及饮食业产生的废物，都可以用不同来源的脂酶进行有效的处理。酶法生产生物柴油[7]日益受到人们的青睐，可利用餐饮业废油脂和工业废油脂为原料，变废为宝的同时降低了生物柴油的生产成本[8]。 （3）脂肪酶在奶酪、面包中的应用[9] 脂肪酶可用于改良食品风味。在适当条件下，脂肪酶生成短链脂肪酸酯、乙醇、丙酮、乙醛、二甲硫醚及低级脂肪酸等风味成分，增强食品香味。如在奶酪生产中，脂肪酶将脂肪降解为游离脂肪酸，游离脂肪酸分解形成有挥发性的脂肪酸，异戊醛，二乙酰，3．羟基丁酮等呈味物质，改善了奶酪风味，并产生特殊香味。脂肪酶还能催化脂肪释放中链脂肪酸产生爽滑感。释放出游离脂肪酸参与化学反应，诱发合成乙酰乙酸、p一酮类酸、甲基酮、香味酯和内酯等香味成分[10]。 （4）脂肪酶在生物传感器中的应用 用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。 （5）脂肪水解方面的应用 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或酯，将其水解为脂肪酸和甘油或醇。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解反应，利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。用于这种目的脂肪酶[11]包括来自Candida rli osa，Pseudomonashuorescen和蓖麻种子(castorbean)等的脂肪酶研究。水解的底物包括各种植物油，如大豆油、蓖麻油、橄榄油等；动物油如牛脂、羊脂和鱼油及各种油的酯类。 （6）脂肪酸的提纯方面的应用 Hoshino等研制了一种富集n-3多不饱和脂肪酸的三甘酯的生物反应器，利用A．niger和C．rugosa、Brassica napu岱脂肪酶不与多不饱和脂肪酸(PuFA)，如．R-亚油酸和二十二烷酸作用，而与其它脂肪酸作用使其优先被释放出来的性质，可制备PUFA含量高的甘油酯。用R．arrh／zus水解茴香油制备岩芹酸(顺式一6一十八烯酸)是完全可能的，因它对这种酸具有高选择性。 （7）手性化合物合成中的应用 脂肪酶催化具有高底物专一性、区域选择性或对映选择性等优点，使其成为有机合成中重要的生物催化剂。脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：（1)前手性底物的反应；(2)外消旋化合物的拆分旧。催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到二醇、二酯、内酯、胺、二胺、胺基醇、Ct或B羟基酸，因此，大多数重要的功能有机化合物原则上都可被脂肪酶催化立体选择性地制备。典型的生物催化剂包括细菌脂肪酶，如P．aeruginosa、P．fluorescens、Pseudomonas、B．cepacia、C．viscosum、Bacillus subtilis、Achromobacter sp．、Alcaligenes和Serratia marcescens以及来自真菌的C．antarctica B和C．rugosa. 5. 微生物脂肪酶的前景与展望[12] 脂肪酶来源不同，导致结构和性质的多样性、不稳定性，使脂肪酶研究进展较慢。固定化脂肪酶可重复利用，提高酶稳定性、有利于实现工业化生产，降低生产成本。目前，脂肪酶固定化因其经济性和技术可靠性，离产业化还有相当大的差距，需对脂肪酶载体、固定化技术作深入研究。今后，脂肪酶研究需生物遗传、生物化工、仪器分析、食品工程等领域的研究人员通力合作， 筛选新的工业脂肪酶菌株，以解决工业生产和保护环境问题。 实验目的 1.掌握产脂肪酶细菌的筛选鉴定方法。 2.筛选出产脂肪酶活性高的细菌，将其确定到种。 实验意义 1.筛选出的产脂肪酶活性高的细菌，将其用于实际生产中。 四．实验器材 显微镜 载玻片 接种环 酒精灯 高压蒸汽灭菌锅 超净工作台 热鼓风干燥箱 恒温磁力搅拌器 离心机 热恒温水箱 精密电子天平 隔水式电热恒温培养箱 便携式pH计 三角瓶（带棉塞） 移液管 天平（带砝码） 钥匙称量纸 三角瓶 培养皿 涂布器 试管 游标卡尺 接种环 五．试剂及药品 5.1 培养基成分及配制方法 1. 富集培养基：酵母粉0．2，Na2HPO4 3．5，K2HP04 1．5，MgS04·7H20 0．5，NaCl 0．5，橄榄油10．0，pH7．0．
2牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏0.3g ，蛋白胨1.0g，氯化钠 0.5g，琼脂 1.5g， 水 100ml．橄榄油 0.05 溴甲酚紫
在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用记号笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.6, 再加入15%琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后 补足失水，分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30分钟。 3.复筛培养基： A.种子培养基：1％蛋白胨，0．5％酵母粉，0．5％橄榄油，0．05％MgSO4·7H2O，0.2％K2HPO4，调pH值至7．0，乳化分装灭菌。 B..初始发酵培养基：1％蛋白胨，0．5％酵母粉，1％蔗糖，1％橄榄油，0．2％K2HPO4 0.05％MgSO4·7H20，0．01％CaCl2，1％吐温80，0．001％FeS04·7H20，调pH值至7．0，乳化分装灭菌 4. LB液体培养基 酵母膏5g／L，蛋白胨lOg／L，NaCI lOg／L用6mol／L Na2CO3调至pH9．0. 5. V—P试验培养基 蛋白胨0．5％，葡萄糖0．5％，K2HPO4 0.05％，pH7.2～7．4。每管分装4～5ml。 6. 硝酸盐还原试验培养基 牛肉膏3g，蛋白胨lOg，NaCI 5g，KNO3 lg，水1000ml，PH7～7．6 硝酸盐显色液： A液：对氨基苯磺酸0．5g，稀醋酸(10％左右)150ml， B液：a一萘胺0．1g，蒸馏水20ml，稀醋酸(10％左右)150ml 7. 脲酶检测培养基 蛋白胨1g，NaCI 5g，葡萄糖lg，K2HPO4 2g， 0.2％酚红水溶液6ml，琼脂20g，蒸馏水1000ml，115.C蒸汽灭菌30min后调pH至6．8～6．9使培养基呈橘黄色，微带粉红，20％的尿素过滤灭菌后和冷却至50～55℃的基础培养基混合，使其终浓度为2％，摆成较大斜面。 8. 葡萄糖氧化发酵试验培养基 蛋白胨2g，葡萄糖lOg，1％溴百里酚蓝水溶液3ml(先用95％乙醇溶解后，再加水配成1％水溶液)，NaCI 59，KH2PO 40.2g，琼脂6g，蒸馏水1000ml，pH7．0～7．2. 9. 明胶液化试验培养基 蛋白胨O．5％，明胶10～15％，pH7．2～7．4，灭菌后用试管分装，培养基高度约为4～5cm. 10. 甲基红试验培养基 蛋白胨O．5％，葡萄糖0．5％，K：HPO。0．05％，pH7．2～7．4。每管分装4～5ml. 11.半固体培养基 酵母膏0．5％，蛋白栋1．0％，NaCI 1．O％，琼脂0．5％，用lmol／LNaOH调至pH7.0 12.菌体运动性试验培养基 蛋白胨0．5％，明胶5～6％。pH7．2～7．4，灭菌后分装试管，培养基高度约为4～5cm。 5.2 常用用储存液及配制方法 (1)lmol／L HCl：取86．2ml浓盐酸加入到900ml蒸馏水中，定容为1L。 (2)lmol／L NaOH：称取40．Og NaOH溶于900ml蒸馏水中，定容为1L。 (3)6mol／L Na2CO3：称取318．Og Na2CO3，溶于400ml蒸馏水中，完全溶解后用蒸馏水定容为500ml，分装，高压灭菌。 (5)0．5％罗丹明溶液：称取0．5g罗丹明溶解在lOOml重蒸水中。
脂肪酶催化拆分外消旋薄荷醇的研究进展
２ ０ １ ３年 ６月
黑 龙 江 科 学
ＨＥＩ Ｌ ＯＮＧ Ｊ Ｉ ＡＮＧ Ｓ ＣＩ Ｅ ＮＣ Ｅ
Ｖｏ ｌ ＿ ４ Ｎｏ ． ６
Ｊ ｕ ｎ ｅ ． ２ ０１ ３
脂 肪 酶催 化 拆 分 外 消旋 薄 荷醇 的研 究 进 展
周舒 扬 ，梁 霆
（ 黑龙江 省科
ｍｅ ｎ ｔ ｈ ｏ ｌ ｂ ｙ ｌ ｉ ｐ ａ ｓ ｅ ｗａ ｓ ｄ ｉ ｓ ｃ ｕ ｓ ｓ ｅ ｄ． Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： Ｌｉ ｐａ ｓ ｅ； ｏ ｐ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｐｕ ｒ ｉ ｔ ｙ； ＤＬ— Ｍｅ ｎｔ ｈ ｏ ｌ ；ｒ ｅｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ
构 的外 消旋体 。
薄荷醇 的八 个 手性立 体 异构 体 的绝 对 构型 如 图 ｌ所 示， 除了（一） 一 薄荷醇和（＋） 一 新薄荷 醇存 在于 天然薄荷 油 中， 其他异构体都是 由合成法制得 的。
等研究了超临界流体 中脂肪酶催化 的手性合 成反应 ， Ｃ ｈ ｒ ｌ ｓ ｏ ．
薄荷 醇 又称 薄荷脑 （ ｍ ｅ ｎ ｔ ｈ ａ ｃ ａ ｍ ｐ ｈ ｏ ｒ ） ， 学名 卜甲基 一 异丙基一 环己． ３ 一 醇， 英 文名 （±） 一 Ｍｅ ｎ ｔ ｈ ｏ ｌ ， 分子 式 Ｃ 。 Ｈ 。 Ｏ， 是非 常重 要的环萜醇手性化合物 。由于薄荷醇分子中存在 着三个不 对称碳原子 ， 所 以它能够 产生 四对不 同的立体 异
种
： 手性 源法 、 不对称合成 法 以及 外消旋 体 的拆 分。 当
然在整个拆分或定 向合成过 程 中可以是两种 途径 的结合 ， 有些步骤是定 向合成 ， 有些步骤是拆分或差 向异构化 ， 从 而 经济有效地达到 目的。此外 ， 一些新 的技术也纷纷用于手 药 物的制备过程中， 如超临界 Ｃ Ｏ ２ 中酶催化手『 生 农药合成 ， Ｙ ｌ Ｊ ｌ ４ Ｊ
脂肪酶催化药物合成的研究进展
芬 、 洛芬和 氟 比洛 芬 等 。最 近研 究人 员 利 用 脂 肪酶 布
在 手 性 药 物 拆 分 中 具 有 的 优 势 ， 合 成 这 四 种 药 物 的 对
生 。脂肪 酶催化 反应 除具 有高 度 的立体选 择性 和 区域
关 键 词 ： 法催 化 ； 肪 酶 ； 物合 成 ； 性 中 间体 酶 脂 药 手
中 图分 类 号 ： ５ ６ Ｑ ５
文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ： ６ ２ ４ ５ ２ １ ） ８ ０ ０ —０ １ ７ —５ ２ （ ０ ０ ０ — ０ １ ７
脂 肪 酶 （ ｉａ ｅ Ｅ ３ １ １ ３ 可 以 水 解 三 酸 甘 油 Ｌｐ ｓ ， Ｃ ． ． ． ） 酯产 生脂 肪酸 、 甘 油 酯 、 甘 油 酯及 甘 油 ， 有 机 溶 单 双 在
基 金 项 目 ： 家 自然科 学基 金 资助 项 目（ ０ ０ ２ ３ 国 ３ ９０ ５ ） 收 稿 日期 ：０ ０ ０ — ２ ２１— ４ ６
萘普 生 ［ ＋ ） 一 基一一 （ ａ甲 ６ 甲氧 基－－ 乙 酸 ］ 世 界 ２萘 是 上 应用最 多 的 非 甾体 类 抗 炎 镇 痛 药 物 。临 床 研 究 表
１ 脂 肪 酶 催 化 合 成 抗 炎 镇 痛 药 物
非 甾体 类 抗 炎 镇 痛 药 物 （ ｎ ｔｒ ｉａ ａ ｔ ｎｌ Ｎｏ ｓｅｏｄ ｌ ｎｉ ｆ ｍ－ ｉ ａ
ｍａｏ ｙｄ ｕ ｓ ＮＳ Ｄｓ是 一类 具有 解 热 、 痛 、 ｔｒ ｒｇ ， ＡＩ ） 镇 抗炎 、 抗 风湿 和血 小板 聚集 作 用 的药 物 ， 主要 用 于 治 疗 多种
作者 简 介 ： 小龙 （ ９ ５ ， ， 熊 １ ８ 一） 男 安徽 六 安 人 ， 士研 究 生 ， 究 方 向 ： 物 酶 及 催 化 ； 讯 作 者 ： 恬 ， 士 ， 授 。 Ｅ ｍａ ：ｉ ｘｅ 硕 研 生 通 谢 博 教 — ｉ ｔ ｎ ｉ． ｌ ａ
脂肪酶的酯合成活性检测方法及其应用研究进展
Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ３ １ ０ ０ １ ４ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； Ｈａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ｂ ｉ ｏ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｐ ｉ ｏ ｎ ｅ ｅ ｒ ｐ ａ ｒ ｋ Ｌ ｔ ｄ ． ， Ｈａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ３ １ ０ ０ ５ ３ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｔｈｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｌ ｉ ｐａ ｓ ｅ ｓ ｙ ｎｔ ｈｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｔ ｈｅ ｒ ｅ ｃ ｅ ｎｔ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｐ ｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｌ ｉ ｐａ ｓ ｅ
脂肪酶催化糖酯合成反应的研究进展1
脂肪酶催化糖酯合成反应的研究进展摘要：脂肪酶催化糖酯的合成通常是在低水活度的有机溶剂中进行的，以使反应朝着合成方向而不是水解方向进行。
这篇综述主要讨论了在非水介质中脂肪酶催化糖酯合成的各种影响因素,主要有底物（糖和脂肪酸）的性质和浓度的影响；溶剂的影响；水活度的影响；温度的影响。
关键词：糖酯脂肪酶温度水活度非水介质1前言糖酯是一类无臭，无味，无刺激性，易被生物降解的非离子表面活性剂。
这些特性使其在食品，化工，医药等领域具有极其诱人的应用前景。
糖酯是通过糖和脂肪酸的酯化反应形成的，反应方程式如下：在工业生产中，在化学催化剂的作用下，可以通过酯交换反应来合成糖酯。
但是，这个反应需要100的温度和低压的环境。
而且催化反应的选择性差，有很多的副产物合成，包含有不同程度酯化和酰化的异构混合物。
整个合成反应的条件苛刻，产物需要困难的多步分离。
酶法合成克服了上述缺点，反应条件温和，由于酶具有高度的立体选择性，区域专一性，和位置选择性，可以合成光学纯的糖酯；产品易于纯化，色泽浅；耗能少，设备投资小，对环境无污染，产品质量好，产量高。
糖酯的合成既可以通过酶法合成，也可以通过化学方法合成。
综合各种因素来看，酶法合成有着更显著的优势。
这篇综述主要总结了在脂肪酶合成糖酯过程中，脂肪酶，温度，溶剂，水活度，反应物对于合成反应的影响。
2脂肪酶脂肪酶主要存在于植物种子，动物肝脏和微生物中。
脂肪酶通常在水相中催化甘油酯水解为甘油和脂肪酸，但是在非水介质中可以催化糖酯的合成。
不同种类的脂肪酶氨基酸序列可能有较大的差别，但是具有相似的三维构象（相似的折叠方式和活性中心）。
脂肪酶仅仅在疏水溶剂和水溶液的界面之间是有活性的，这与它的活性中心的构象有关。
脂肪酶拥有亲核试剂—组氨酸—酸式残基组成的三元集团，这个三元集团是Ser-His-Glu或者Ser-His-Asp。
脂肪酶的活性中性被一个螺旋片段所包围（又称为“盖子结构域”），使得脂肪酶的活性中心不易被溶剂和底物接近。
碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化
碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化摘要利用筛选和验证相结合的方法筛选出了产碱性脂肪酶活性较高的菌株bl1011。
经过形态观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，结果表明该菌株为假单胞菌（pseudomonas sp.）。
运用单因素试验和均匀试验优化了bl1011菌株摇瓶产酶培养基和最佳发酵条件。
在培养基为麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，大豆油0.5%，k2hpo4 0.2%，培养条件为起始ph值7.5，温度33 ℃，转速180 r/min，装液量20 ml，发酵周期为60 h的条件下，酶活力达到最高，为223 u/ml。
关键词脂肪酶；筛选；发酵优化；均匀试验中图分类号 q55 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2012）22-0274-03脂肪酶（lipase，e.c.3.1.1.3，又称三酰基甘油水解酶）是一种特殊的酯键水解酶，能在油水界面催化油脂水解，生成甘油和脂肪酸，具有化学选择性和底物选择性[1]。
脂肪酶被广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域[2]。
尽管自然界中产脂肪酶的微生物很多，但用于商业化生产的细菌很少，主要有伯克霍尔德氏菌（burkholderia）、无色杆菌属（achromobacter）、假单胞菌属（pseudomonas）、色杆菌属（chromobacterium）、产碱杆菌属（alkaligenes）、节杆菌属（arthrobacter）[3]。
假单胞菌产碱性脂肪酶国内外虽有研究，但酶活力均不高[4]。
该研究通过罗丹明b平板法快速筛选出一株产碱性脂肪酶能力较强的菌株，并对其产酶条件进行优化研究。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株。
细菌：bl1001-1020；酵母：bl2001-2015；霉菌：bl3001-3025。
试验菌株均由郑州轻工业学校食品与生物工程学院酶分子工程研究室保藏。
1.1.2 培养基。
①种子培养基。
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
霞品研究与开发
Ｆｏ ｄＲｅｅ ｒ ｈ Ａｎ ｖ ｐ ｎｔ ｏ ｓａ ｃ ｄＤｅ ｄｏ ｍｅ
２１ ０ １年 ６月
第３ 卷 期 １ ２ 第６ １ ９
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
李 鑫玲 ’孙晓菲 ’孟楠 ’ 卜 ， ， ， 美玲 ’刘进 。
（． １河南科 技大学 食 品与生物 工程学 院 ， 河南 洛阳 ４ １０ ； ． 岛啤酒 （ ７０３ ２青 太原 ） 有限公司 ， 山西 太原 ０ ０ ３ ） ３０ ２
４ 结 语
Ｃ ｏｅｅ ［ ． ｕｒｉｎＲ ｓａｃ ， ０ ，６ ５ ６ ５ ０ ｒ ａ ｔｎｓＪ Ｎ ｔ ｔ ｅｅｒｈ ０ ６２ ： ５ — ６ １ ｉｏ ２ 【】 Ｊｎ ａ Ｍ． ｏｄ ＇－ ｕｉ＇ ｅ ｎ ｒ ｏｏｅ ｕ ｕ ｅＣ ｓ ｏ ３ ａｎｔ Ｒ ｌａ Ｇ ｔ ｒ ｚａｄＭａ ａＤ ｌｒｓＬ ｑ ｅｄ ａｔ ． ｎ ｅｒ ｉ ｒ
摘 要 ： 土壤样本 中分 离出一株具有较 高活力 的产脂肪酶 菌株 ， 步确定为假 单胞菌属。对该 脂肪 酶产 酶条件进 从 初
行 优 化 ， 佳 碳 源为 糊精 、 最 氮源 为 硫 酸铵 ， 适发 酵 温度 为 ３ ， 最 ０℃ 最适 起 始 ｐ 为 ７ 。 Ｈ ． ０
关键词 ： 脂肪酶 ； 假单胞菌属 ； 产酶条件
６・ Ｏ
芎。 ０ 墓４ 。 ０
赡 ３０ ．
速搅 拌均匀 ， 高压灭菌倒板前再用磁力搅拌器混匀 ； 种
子培养 基 （ ： 萄糖 ２ ，Ｎ ２ ．， Ｐ ４ ．， ％）葡 ． （ Ｈ ） ０ ０ ＫＨ Ｏ ０１ ０ ｓ ５ 橄榄油 １ ， Ｓ ７ ． ， 白胨 ２５ ｐ ．； 酵 ． ＭｇＯ ・Ｈ ００ ５ 蛋 ０ ０ ．，Ｈ ７ 发 Ｏ 培养基（ ： 白胨 ２ ， ％）蛋 ． 蔗糖 ０ ， ０ ． 橄榄油 １ ，Ｎ ４￣ ４ ５ ． （ Ｈ ） Ｏ ０ Ｓ
脂肪酶综述
脂肪酶与生物柴油的催化合成摘要：脂肪酶已成为工业生产所需的一种重要用酶。
已广泛应用于食品、药品、日用化工等领域。
本文综述了脂肪酶的结构、应用、催化机理以及在生物柴油生产中的研究进展。
关键词：脂肪酶，催化机理，生物柴油0 前言脂肪酶，又称甘油酯水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯的酯键的酶，它是一类具有多种催化能力的酶，被广泛用于三脂酰甘油及其他一些水不溶性脂类的水解、醇解、酯化、转酯化及脂类逆向转酯反应酯类的逆向合成反应[1]中。
图1、2 脂肪酶催化酯相关的反应脂肪酶的种类众多，包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶等。
广泛存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。
比如高等动物的胰脏和脂肪组织、油料作物的种子、真菌和酵母等都含有较多的脂肪酶。
脂肪酶的分子量因其来源不同而差异很大，不同来源的脂肪酶，其氨基酸组成数目从200-700不等，其分子量也从29-100kDa不等。
1 脂肪酶的结构功能与应用1.1 脂肪酶的功能脂肪酶作为酯水解酶，自然可以催化酯的相关反应，比如酯的水解、酯的合成、酯交换等反应，脂肪酶对生命体的代谢起到重要的作用：动物体内，各类脂肪酶控制消化，吸收，脂肪重建和蛋白质代谢等过程；当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必须的养料和能量。
脂肪酶的最适温度一般在30-60℃之间，最适pH一般为6-10，不同来源的脂肪酶的最适合的温度和最适合的pH差异比较大。
1.2 脂肪酶的结构及催化机理脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。
它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
对脂肪酶活性中心的研究发现，八联体β-折叠间隔被两亲的α-螺旋连接起来共同构成了脂肪酶的活性中心，不同的脂肪酶都有一个相似的起催化作用的“Ser-Asp/Glu-His”三联体，三个氨基酸残基分别位于活性中心具有疏水性的β5、β7、β8折叠片的后面[2]。
微生物酶分子改造研究进展
近年来，科研人员通过基因工程、蛋白质工程等手段对酶分子进行改造，以 提高其稳定性。以下是这方面的一些研究进展。
1、定点突变技术：通过定点突变技术，可以在酶分子中引入或替换特定的 氨基酸残基，以改变酶的稳定性。例如，将谷氨酸残基定点突变为赖氨酸，可以 提高酶在高温条件下的稳定性。
2、融合技术：将酶分子与其它蛋白质或蛋白质片段进行融合，可以改变酶 的稳定性。例如，将抑酶蛋白与目标酶进行融合，可以显著提高酶的热稳定性。
3、蛋白质工程：蛋白质工程可以利用计算机辅助设计，对酶分子进行全局 或局部的改造。通过优化酶分子的三维结构，可以显著提高酶的稳定性。
4、噬菌体展示技术：噬菌体展示技术可以利用噬菌体为载体，将目标酶分 子与噬菌体蛋白融合表达。通过选择合适的配体，可以得到高稳定性的突变体酶。
5、结构生物学指导：结构生物学可以揭示酶分子稳定性的结构基础。通过 对稳定性和不稳定性的氨基酸残基进行鉴定，可以指导改造过程，提高酶的稳定 性。
研究方法
分子酶工程的研究方法主要包括实验设计、基因克隆、定点突变、蛋白质表 达与纯化、活性检测等多个环节。首先，研究者需要根据具体需求设计实验方案， 确定需要改造的酶基因序列和蛋白质结构。接着，通过基因克隆技术将目的基因 导入表达载体中，实现目的基因的高效表达。
研究结果
近年来，分子酶工程的研究成果显著，主要表现在以下几个方面：
微生物酶分子改造研究进展
基本内容
微生物酶是一种具有高度特异性和催化效能的生物分子，在许多工业和生物 技术应用中具有重要作用。由于微生物酶的特性和功能往往取决于其蛋白质分子 的结构，因此，对微生物酶分子的改造和优化成为一个重要的研究领域。这种优 化可以通过定向进化、理性设计或组合方法来实现，以改进酶的活性、稳定性或 选择性。
微生物脂肪酶的研究与应用 (1)
DOI：CNKI:11-1759/TS.20120210.1743.006 网络出版时间：2012-02-10 17:43网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20120210.1743.006.html微生物脂肪酶的研究与应用刘虹蕾，缪铭，江波 ，张涛(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)摘要：脂肪酶是一类能够催化酯的水解反应以及在非水相体系中催化脂肪酸和醇类发生酯化反应的酶类。
随着酶学技术的快速发展，微生物脂肪酶也受到了越来越多的关注。
作为生物催化剂，脂肪酶一直以来都是生物技术领域中最重要的一类酶。
本文探讨了脂肪酶的来源、理化性质、脂肪酶活力测定，同时对脂肪酶的非水相催化特性以及脂肪酶在食品工业，医药、洗涤剂、皮革、造纸和生物柴油工业领域中的应用进行了讨论。
关键词：脂肪酶；酶活测定；非水相；食品工业应用Research and applications of microbial lipasesLiu Hong-lei, Miao Ming, Jiang Bo, Zhang Tao(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: lipases are a class of enzymes which catalyse the hydrolysis of esters and esterification of fatty acid andalcohol. Lipases constitute the most important group of biocatalysts for biotechnological applications. This reviewdescribes physicochemical origin and properties of lipases, lipase activity determination, catalytic properties oflipases in nonaqueous phase and various industrial applications of microbial lipases in the food, pharmaceuticals,detergent, leather, papermaking and biodiesel.Key words: lipases; lipase actiity determination; Nonaqueous phase; food industrial applications脂肪酶（三酰甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3），是一类广泛存在于多种微生物中的生物催化剂。
脂肪酶的提取与分离纯化
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响 。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂 肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
金属离子
组特异 性试剂
修饰剂 温度
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
PH
MTCC5695脂肪酶显示在pH值10.8的最佳活性表明它是碱性的。
PH值在7.0-12.0之间时酶呈现了稳定性。在强酸性环境下，活动完全丧失
了活性，pH值为6.0时，酶活性很弱。
温度
MTCC5695脂肪酶活性的最佳温度是40度。脂肪酶在30-70摄氏
最适宜的系统是磷酸氢二钠系统，其中恢复率为61.87%的脂肪酶具有特 异性活性417.43U/mg和净化因子2.62。对细胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小 麦面粉的植物酯酶被ATPS提取和纯化效果不错，净化因子(PF)为18.46倍，产 量为83.16%。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成高聚物的影响
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3.2.2 双水相萃取技术的分离与超滤
底相的超滤作用下使得磷酸钠与MTCC5695脂肪酶分 离，从而将纯化因子从4.12提高到5.99，酶的回收率为 82.09%。纯度的增加可以归因于通过膜和磷酸钠进行的 污染物蛋白的渗透。超滤装置的使用促进了MTCC5695脂 肪酶的分离;这反过来又增加了浓度，而纯度却未受影响。 先前的研究报告说，膜处理(超滤)与ATPE的整合不仅促进 了相形成成分与产品的分离，而且也增加了蛋白的纯度。