微生物脂肪酶的研究进展 (1)

生物技术通报
Biotechnolog y Informat ion
1999 年第 2 期
#综述进展#
微生物脂肪酶的研究进展
Advances in the Research on Microbial Lipase
彭立凤 Peng Lifeng
河北师范大学化学系 , 石家庄 050016 T he department o f chemistry Heibei Nor mal Univercity , Shijiazhuang 050016
[ 34]
等筛 其在
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1999 年第 2 期 span 及糖脂能刺激胞外酶的产生。陶文沂 [ 2] 报道微 量 C a2+ 可促 进地 霉 产酶 , 浓度 高 则呈 相反 效 果。 Yoshit aka K 、 报道 Fe 、 Fe sp 产酶, Ba
发酵 摇瓶 摇瓶 30L 发酵罐 摇瓶 摇瓶 20L 发酵罐 20L 发酵罐 15L 发酵罐 摇瓶 摇瓶 摇瓶 30L 发酵罐 摇瓶 2L 发酵罐 固态发罐 摇瓶 液体深层发酵 100L 发酵罐 塔式及 3L 通风搅拌 罐 静止液体培养 摇瓶 摇瓶 600 发酵罐 20L 发酵罐
10. 8 15. 8 6. 0 500. 0 [ 9] 75. 0 800. 0 [ 10]
43、 44] 成功报道 [ 2 、 。常 采用的一 些诱变 处理有 紫外
游离脂肪酸 [ 30] 及其某些结构类似物如司班、 聚乙二 醇单 油 酸 酯 等表 面 活 性 剂 。 但也 有 相 反 的 报 37] 道[ 36、 , 高修功[ 38] 等也报道 假单胞菌产脂肪酶不 受脂类底物的诱导。但多数实验表明, 添加脂类到 培养基中能引起脂肪酶产量的明显增加 。陶 [ 3] 文沂 等报道在一定的添加范围内, 油脂表现为诱 导作用, 超 过某一界限后 则不同油 脂工效应 不同。 他们还试验了几种主要脂肪酸对产脂肪酶的影响, 结果表明 , 不饱和脂肪酸对脂肪酶的形成有明显的 促进作用 , 这与谢舜珍[ 30] 等的报道一 致, 而饱和脂 肪酸则作用不明显。琥珀酸钠和吐温 80 对地霉菌 株有明显的负控制作用。 脂肪酶发酵的碳源通常为碳水化合物 ( 如葡萄 糖、 可溶性淀粉、 糊精、 糖蜜、 麦麸、 小麦粉等, 碳源的 种类通常对脂肪酶发酵无明显的影响 。某些 微生 物 还 可 利 用 油 脂 或 脂 肪 酸 作 碳 源 如 Geotr ichum sp . 菌
[ 3]
等采用类似的油同 化平板, 以油脂 ) 17 )
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1999 年第 2 期 脂平板检测法, 该法适用于产脂肪酶的微生物菌种, 检测菌种发酵液中脂肪酶活力以及其它样品中的脂 肪酶活力的大小 , 在该平板上 , 产脂肪酶的菌体的菌 落外围有微红色水解带 , 脂肪酶溶液浓度的对数与 水解圈直径呈很好的线性关系 , 与滴定法及比色法 相比该平板检测法简便、 可靠、 灵敏。
[ 30] [ 38 、 40] [ 39、 30、 3] [ 3]
。金 其荣
[ 32]
以氢化油 为唯一
线、 亚硝基胍、 盐酸羟胺、 5- 嗅尿嘧啶、 秋水仙等 , 或 几种复合使用 , 筛选丁酸 或已酸的 的抗性变 异株。 施巧琴 pH [ 43] 采用上述五种处理结合使 Penicil li um ex p ausum ( 扩展青霉菌 ) 菌产酶活力比原始菌株提 高了 17 倍。 借助 基因 工 程 , 脂 肪 酶 的 产 量 能 大 大 提 高。 1987 年 , NoVo 公司用安全性已得到证实且酶生产 力高的曲酶菌 ( A spergil lus oryz ae) 的遗传因子改造 H um icola l anugi nosa 霉( 柔毛腐质霉 ) , 从而生产出 了大量的 lipolase 。我国翁丽星 等人将类产 碱假单胞菌 ( Pseudomodas p seudoalcal igene ) 总 DNA 经 Sau3A1 部分酶解后的 35~ 50kbDNA 片段与经 BamH I 线性化及 CIAP 处理过的粘粒 p1J285 连接, 以大肠杆菌 LE 一领域最新、 最重要的进展。迄今 , 只有很少几种脂 肪酶的基因得到克隆和定序。通过将脂肪酶的基因 ) 19 )
摘
要:
详细综述了脂态酶微生物产生菌的选育 、 诱变育种及发 酵生产技术 , 对微 生物脂肪酶 的性质、 分离、 纯化、 微生物脂肪酶 ; 菌种选育 ; 脂肪酶发酵 ; 纯化 ; 固定 化 T he screening, induced mutation and fer mentat ion of microbial strains that produce lipases were review ed in de microbial lipase; screening of microbial str ain; lipase fermentation; purification; immobilization
21] 酶[ 15] , 诱导物可以是 甘油三酯、 长链 脂肪酸[ 11 、 、 [ 9]
、 能促进 A lcal igenes
、 Co
2+
对后者无影响。吴松刚 [ 40] 报道,
聚氧气烯十六烷基醚、 聚氧乙烯十二烷基醚、 聚氧乙 烯辛基苯基醚和吐温 40 可不同程度地提高脂肪酶 的产量, 而咪唑则抑制产酶。 许多人对起始 pH 对脂肪酶产量的影响做了研 究, P al 等 [ 17] 研究了 pH 对 A sp ergill us niger 脂肪酶 发酵产量的影响, 在发酵过程中经常调整 pH 使之 与初始 pH 相同, 发现产酶与生产均在 pH 7 时达到 最大 , 但 pH4. 0 时单位菌体的脂肪酶产量高于 pH7. 0 的单位菌体的脂肪酶产量。施巧琴[ 31] 研究了 pH 对霉菌和细菌产碱性脂肪酶的影响 , 发现大部分霉 菌在 pH 7. 0 培养基中产酶量最高, 在 pH 10. 0 其表 面产生部分菌丝体, 并产生一定量的脂肪酶, 静止培 养 时霉菌的产霉量高于细菌, 如采 用摇瓶培养, 在 pH 10. 0 细菌的碱 性脂肪酶 产量高 , 霉菌几 乎不产 生。说明霉菌大部 分产酶最适 pH 是远离 作用 pH 的, 而细菌则是相近。 除以上优化各种培养基可获得高产菌株外, 还 可以采用一些诱变方法改良菌种 , 这方面已有一些
为唯一碳源进行同化试验 , 分别筛选出较高酶活菌 株, 施巧琴
[ 31]
采用脂肪酶作用脂肪后产生的脂肪酸
与维多利亚蓝反应呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产 碱性脂肪酶的扩展青酶; 金其荣 [ 32] 以氢化油为唯一 碳源, 36 e 培养 , 筛出一株高温的根霉菌 ; 李祖义[ 33] 介绍一种含一定浓度的橄榄油和 Rhodamine B 的琼
[ 1]
趣[ 3~ 4] , 微生物脂肪酶将使诸多传统产业面临新的 挑战。
1
产脂酶微生物的选育
脂肪酶 在微生物界分布 很广, 据 估计, 细菌有
28 个属、 放线菌 4 个属、 酵母菌 10 个 属、 其它真菌 23 个属共计达 65 个属的微生物产脂肪酶
[ 1]
。实际
上, 脂肪酶在微生物界的分布远超过此。一方面是 研究还不广泛, 多半局限于有经济意义的属中; 另一 方面是多数测定未使用微量分析 , 这就会把产酶量 低的菌株误认为不产脂肪酶。几种高产脂肪酶的微 生物菌株列于表 1 中。 筛选分离脂肪酶产生菌常用的方法是用含有甘 油三酯的琼脂平板, 酶催化水解产生清晰的环带或 浑浊的脂肪沉淀, 也可利用生色底物或产脂肪酶微 生物的某些特性。如松村亲 [ 26] 报道的适用于霉菌 筛选的牛脂法 ; Saty anarayata
2 脂肪酶产生菌的发酵生产及诱变育种
尽管脂肪酶微生物容易发现 , 但寻找适于工业 生产的脂肪酶产生菌及其发酵条件却非常困难, 文 献报道的脂肪酶产量都很低 , 通常在 mg / 1 的水平。 通过传统诱变育种以及优化发酵条件提高了脂肪酶 ) 18 )
产量, 使得许多脂肪酶实现了工业化生产。尤其是 基因工程的引入, 大大提高了脂肪酶的产量。 2. 1 脂肪酶有微生物细胞中的分布 大多数微生物所产生的脂肪酶属胞外酶, 如朱 明华
[ 27]
利用固体培养基 , 观
察脂肪酸沉淀以确定酶活大小的方法; Yeoh [ 28] 利用 生色底物 P - 硝基苯辛酸盐 , P - 硝基苯肉蔻酸盐和 P 硝基苯棕榈酸盐筛选对不同碳链长脂肪酸具有专一 性的 脂 肪酶 产生 菌; 我国 研 究者 王美 英 珍
[ 30] [ 29]
、 谢舜
、 陶文沂
微生物脂肪酶 ( EC 3. 1. 1. 3) , 又称三酰基甘油 酰基水解酶, 是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇 形成的甘油三酸酯酯键的酶。本世纪初发现微生物 脂肪酶以来 , 由于种类多 , 具有比动物脂肪酶更广的 作用 pH 、 作用温度范围和对底物的专一性类型, 又 便于进行工业生产, 获取高纯度制剂以及微生物脂 肪酶在酶理论研究和实际应用中的作用而得到广泛 研究 。它是一种重要的工业酶类, 应用于油脂水 解、 食品风味和香味的改进、 医疗医药、 皮革绢纺脱 脂、 低等油脂的改性、 添加于洗涤剂和化妆品中等。 特别是在油脂化工和有机合成工业中, 酶催化的反 应具有条件温和、 耗能低、 原料要求低、 成品质量高 等优点, 尤其 是 1, 3 - 专一 脂肪酶, 可用于 特殊脂肪 酸、 单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分 , 具 有巨大应用潜力。但由于脂肪酶成本高, 不能引起 脂肪酶工业化兴趣, 所以没有大量制备[ 2] 。 近二十年来 , 深入研究和应用于工业生产的微 生物脂肪酶种类不断增加。目前已遍及细菌、 酵母 及霉菌各大类中, 并借助于遗传工程提高了脂肪酶 的产量。同时, 随着生物技术的日新月异 , 酶固定化 技术 , 界面酶学和非水酶学研究与应用的突破性进 展, 使 得 人 们 对 微 生 物 脂 肪 酶 产 生 了 极 大 的 兴