神经细胞培养
神经胶质细胞培养方法
神经胶质细胞培养方法
神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底
层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增殖。
而神经胶质细胞是神经组织
中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质
细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。
一般来说，胶质细胞在培养
中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，
可用劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus,ROUS)和SV4等能其诱发转化。
培养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一至二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打
即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然
下沉，脂肪等杂物易漂浮在上层液相中，可吸除上层液体，反复二至
三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细
胞密度。
5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。
贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。
细胞传代可以 0.25%胰酶消化处理。
神经细胞的培养
海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。
暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。
2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。
培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。
一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。
其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。
4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。
后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。
结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。
6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。
neurobasal 神经细胞培养步骤
neurobasal 神经细胞培养步骤
神经细胞培养使用的神经基底培养基（Neurobasal）通常包括
以下步骤：
1. 准备培养器具：将所需的培养器皿（如细胞培养皿、培养瓶等）进行灭菌处理，确保无细菌或其他污染物。
2. 制备培养基：根据厂家提供的说明书，将神经基底培养基配制好。
通常需要将粉末溶解于培养基补充剂（如B27或N2）中，并加入适量的血清等。
3. 细胞分离：将神经组织（如海马、皮质等）分离并收集。
可以使用酶（如胰酶、纤溶酶等）或机械切割方法（如切割刀或离心式分离）。
4. 细胞孵化：将分离的细胞在预先灭菌的培养器皿中分散均匀，加入预先配制好的培养基。
5. 营养物质补充：在培养基中加入适量的营养物质，如氨基酸、维生素等，以促进细胞生长和分化。
6. 培养条件调节：将培养器皿放入恒温培养箱中，并保持适宜的温度（通常为37°C）和湿度，同时提供适量的CO2（通常
为5-10%）。
7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况，检查细胞形态和健康状况。
适量更换培养基，以保持培养环境的稳定。
需要注意的是，具体的步骤可能会因实验设计的不同而有所差异，因此最好参考实验操作手册或厂家提供的指导。
此外，神经细胞培养也需要一定的专业知识和操作经验，对于初学者来说可能需要辅导或指导。
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。
文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。
此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。
根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。
基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。
本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。
二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。
神经胶质细胞培养步骤
神经胶质细胞培养步骤神经胶质细胞（neuroglial cells）是存在于中枢神经系统（中枢神经系统包括大脑和脊髓）的细胞类型之一、它们的主要功能是支持和维持神经元的正常功能，同时还参与神经元之间的相互作用。
在研究神经学和神经生物学领域，神经胶质细胞的培养是非常重要的工具和实验方法之一、下面将详细介绍神经胶质细胞的培养步骤。
材料和仪器准备：1.细胞培养培养器皿（如培养瓶、培养皿、多孔板等）2.神经胶质细胞培养基（含有适当的营养物质和生长因子）3.显微镜4.无菌操作台和器具（如无菌架、无菌套、培养器具等）5.离心机6.细胞计数器步骤：1.无菌操作准备：首先，在无菌操作室准备好所有的材料和仪器，并确保它们是无菌的。
洗手，戴好手套和口罩，使用紫外灯照射操作台和仪器，以确保无菌条件。
2.器皿涂层：在培养瓶、培养皿或多孔板中涂覆组织胶质或其他与神经胶质细胞黏附相容的涂层物质（如聚-L-赖氨酸或明胶涂层）。
涂层后，将器皿在37℃的培养箱中孵育至少2小时以促进涂层物质的固化。
3.细胞分离：将小鼠或大鼠的中枢神经系统取出，通常是大脑和脊髓。
将组织放入无菌PBS（磷酸缓冲盐溶液）中，用剪刀剪碎组织，然后离心收集组织碎片。
将组织碎片转移到含有消化酶（如胰酶）的消化液中，并在37℃下消化一段时间，以分离细胞。
4.筛选和培养胶质细胞：经过消化的组织混悬液通过筛网或过滤膜进行过滤，以去除大块组织碎片。
收集过滤液，将其离心以沉淀细胞。
将沉淀的细胞重悬于神经胶质细胞培养基中，并将其转移到事先涂层的器皿中。
将培养皿放入37℃的细胞培养箱中培养。
5.细胞培养：在细胞培养箱中维持恒温和湿度，并使用细胞培养基按照指定的时间间隔更换培养基，通常为2-3天一次。
根据实验要求和研究目的，可以添加适当的生长因子和抗生素到细胞培养基中。
6.细胞观察：使用倒置显微镜观察培养的细胞，注意观察细胞的形态、增殖情况和细胞表型。
同样，能够观察到细胞的汇集和神经胶质细胞的突触形成。
神经干细胞的培养
神经干细胞的培养一、神经干细胞的分离和传代无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μｌ。
待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μｌ。
此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。
二、BrdU标记将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
三、神经干细胞的诱导分化选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。
另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。
四、条件培养液的制备取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。
五、神经干细胞的定向诱导分化将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChAT免疫细胞化学染色。
六、免疫细胞化学染色培养细胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分别行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫细胞化学染色，用DAB和H2O2作为呈色剂，阳性着色为棕黄色。
个人整理总结神经细胞和胚胎细胞培养操作注意事项及相关protocols
Drosophila S2 cell culture protocols陈文锋一、基本注意事项（一）无菌操作培养所需一切物品、液体应无菌。
操作前先列出所需物品，培养液须室温平衡，所有物品准备好后再操作，避免往复拿取用品。
有关数据的计算要事先做好。
（二）操作区消毒进入细胞室内换穿里面的拖鞋。
无菌培养室每周用0.2%的新洁而灭（苯扎溴铵）拖地面1次（拖布专用），紫外照射15-30min。
超净工作台使用前后需用75%乙醇擦洗，然后进行紫外灯照射15~30min进行消毒，操作时打开风机。
紫外照射期间不能放置培养细胞和培养液等。
所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。
工作台面均需经75%乙醇擦拭消毒，特别是液体溢出时，需立即擦拭。
移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%乙醇擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。
废液缸、污物盒每次做完实验马上清理倒掉。
（三）洗手和着装乳胶手套75%乙醇喷洒消毒。
白大褂定期高温高压灭菌。
（四）火焰消毒培养或其他无菌操作时，首先点燃酒精灯。
安装管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰近处。
二、细胞培养条件S2细胞培养在Schneider's Drosophila Medium + 10% FBS的培养基中+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，25℃无需要CO2培养。
五、FBS分装及灭活分装：初次买500ml血清，4℃完全融化（过夜差不多20h，时间比较长），期间间隔混匀。
无菌操作分装于50ml离心管（直接倒，但是注意不要让血清瓶和离心管接触）。
同时分装几管15ml的（15ml不好倒就用枪或移液管操作）。
（-80℃保存）再次分装：等15ml的分装血清用完。
把50ml的血清取出，4℃完全融化，期间间隔混匀。
无菌操作分装于15ml离心管。
灭活：把装有灭菌水的烧杯置于56℃水浴锅中，等水浴锅温度恒定，把装有血清的15ml离心管放于烧杯中，水位应超过血清的位置。
灭活30 min，每隔10min混匀一次。
神经干细胞原代取材与培养
神经原代干细胞的取材及培养长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。
因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。
神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
一、神经干细胞神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。
原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。
神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。
②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。
③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。
总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。
二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养1.原代取材（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。
（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。
重复2-3次。
（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。
用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。
（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。
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传代时注意事项：a 细胞没有生长到足以覆盖瓶 底壁大部分 表面以前，不要急于传 代 b 注意观察不同细胞有不同的消化时 间；动作要轻柔，避免损伤细胞 c 首次传代时细胞数量要多一些，使 细胞尽快适应新环境
鉴定：星形胶质细胞鉴定： 胶质原纤维酸性蛋白 （Glial fibrillary acid protein GFAP）
少突胶质细胞 鉴定：GalC（ß -galactosidase)
GFAP
human Schwann cells
3 神经干细胞（NSE）的培养： NSC：是可以自我更新又可分化为中枢神经系统内 所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞。 20世纪神经生物学领域的最重要进展之一就是 在脑组织等神经系统内发现了NSC，向过去几百年 来认为中枢神经系统损伤后不能再生的传统理论发 出了挑战，也使神经科学工作者从一个崭新的角度 去认识脑、认识疾病、认识人类自身；同时也为神 经变性疾病、脑缺血、脑外伤和脑肿瘤等神经系统 疾病寻求了一条新的途径 神经干细胞的来源： 胚胎干细胞；骨髓基质细胞; 成年的SVZ 和海马齿状回的颗粒细胞层
4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性
５ 细胞的生长过程：
原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代 之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分 成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为 传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系： 原代培养 传代期 衰退期
ciliary neurotrophic factor/leukemia inhibitory factor/gp130 receptor
complex operates in the maintenance of mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci, 2001; 21(19): 7642-53.
传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的 培养瓶的过程称之为传代。
培养的方法： 1）取材 脑灰质或白质 2）洗涤 （Hanks液） 3） 移入试管吹打形成单细胞悬液
4） 静置10min 弃上层
5）过滤后收集细胞悬液，调整细胞密度 104~106/cm2接种于培养瓶，常规CO2孵育箱 培养 6）传代, 0.25% 胰蛋白酶消化（覆盖细胞 层即可）
聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min
3）细胞准备(大鼠神经细胞培养）：
• 新生1～3d SD大鼠，75%酒精浸泡约5min，移入超 净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于DHanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织， 放入10ml小瓶中 •剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振 摇促消化。消化约20min， •用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔 吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制 成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次 10min， •吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，
2.1 主要试剂及溶液的配制 2.1.1 无血清培养基 DMEM/F12培养基 1袋 NaHCO3 3.7g 溶于1升经高压灭菌消毒后的去离子水中， 0.22um滤膜 过滤,分装，4℃保存。使用前，加入EGF(20ng/ml)和/或 bFGF(20ng/ml) 和/或LIF、N2和鸡胚浸出液（5%）。加 50%血清和10%DMSO。 细胞消化液： 配成0.5%的胰蛋白酶(用高压的PBS)并以0.22um滤膜过 滤, 同时配成0.04%EDTA（用D-Hanks液）高压灭菌消毒 , 将两种液体以等体积混合使其终浓度为0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA，分装，-20℃贮存。
无限细胞系： 滞留期 指数增长期 平台期
２０ 原 代 培 养
１８
指 数 细 胞 数 量
细胞系阶段
１６
无限细胞系
１４
１２
１０
有限细胞系
８
６
０ ２
４
６
８
１０
１２
２４
３４
４４
培养时间（周）
６ 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 促生 长因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类 为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及 CO2的值： CO2=5%；空气=95%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L
神经元的观察：刚分离出的神经元呈圆形，
用倒置显微镜观察有明显的光晕。 •接种一般在6小时可贴壁；8小时已有纤细有 突起长出 •24小时后可见细胞体积开始增大，呈圆形或 椭圆形。生长良好的细胞可见胞体周围有明 显的光晕，立体感强，突起以单、双突起为 主 •培养至第4天，神经元胞体明显增大，形态 多样，有些具有分枝的突起， •培养7天后，神经元形态基本成熟，具有光 滑的胞体，发育良好的突起。
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的培养特点 呈神经球形式生长 发展史: Reynolds和 Weiss[1]在体外用表皮生长因子（ Epidermal Growth Factor, EGF）从脑组织中培养出神经 球并发现其能分化成神经元、星型胶质细胞和少突胶 质细胞；将初次形成的神经球消化传代可形成二级神 经球，它们同样具有多向分化潜能；说明EGF在体外可 将NSCs维持在未分化状态并可促进其增加细胞数量。 Johe [2]和Gritti[4]则用碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）也同样从脑组织中获 取到呈神经球形式生长的NSCs，也可以促进这种具有 多向分化潜能的神经球在体外存活和增殖. Shimazaki的 实验证明白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor, LIF）可将来自哺乳动物前脑的NSCs在体外培养条件下 维持在未分化状态增殖[3] 。
• 用含20%血清的DMEM培养基，稀释细胞制成 1×106/ml细胞悬液，接种于经聚Ｌ赖氨酸处理过的 24孔培养板（板孔放置0.8х0.8cm的小盖玻片）或培 养瓶内，放入5%CO2培养箱，37℃培养。 ４）神经元的纯化：培养两至四天后用含5~10 mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养24 hour ,然后改 用常规培养液。 ５）神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶 （ Neuron specific enolose NSE）、 微管相关蛋白 （Microtubule associated protein MAP2） ——神经元,
8．00 0．20
8．00 0．40
第 二节：神经细胞的培养技术
神经元的原代培养 神经胶质细胞的培养 神经干细胞的培养
一 神经元的原代培养(Primary culture) 常用试剂 1）DMEM 培养液：加10%热灭活胎牛血清，30m mol/L 葡萄糖，293.2mg/L L-谷氨酰氨，24.5m mol/L KCl， 100mU /L 胰岛素，青、链酶素各10万µ ／Ｌ，HEPES 2.8383g／Ｌ—PH 值7.2，过滤除菌，-20 ℃保存。 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（ HBSS）
Reynold BA, Weiss S . Generation of neurons and astrocytes from
isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science , 1992 ,255:1707-1710. 2 Johe KK, Hazel TG, MaKay RDG, et al . Single factors direct the differentiation of stem-like cells from foetal and adult nervous system. Genes Dev, 1996; 10: 3129-3140. 1 3Shimazaki T, shingo T, weiss S. The
3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生 长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、 底物、培养基等；间接接触者—配制培养 基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染
常用的培养用液及培养基
培养用液：水
平衡盐溶液（ＢＳＳ） 消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） ２ 二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ） ３胶原酶
神经细胞培养
第一节：细胞培养的基本知识
1定义： 细胞培养 (cell culture)： 组织培养 (Tissue culture) ：
器官培养 ( organ culture)：
统称为体外培养 （In vitro)
2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞
2）：研究条件可以人为的控制
3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差 异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性
MAP-2
A
B
NSE stain neuron
TH stain neuronConfocal laserscan images of organtypic slice culture from avian hippocampus
N
Slice culture. Lucifer yellow stain (bar 50µ m)
取材：取3月龄Waster大鼠一只解剖显微镜下用显微手术 镊剥除脑膜及血管，分别取出海马和室管膜下区组织，置 于盛有冰冷D-Hank’s液的平皿中。 • 用双面刀片将组织切成1mm3的块状 • 组织移入已预温至37℃含有0.25%胰蛋白酶 (Trypsin) 和0.02%EDTA的10ml离心管中消化，离心5-10分钟，弃上 清，用含高糖的DMEM/F12(1:1)重悬细胞, 用300目滤网过 滤.按10%的比例加入血清，培养12-16小时或过夜。 • 更换成完全培养基（添加5%CEE、bFGF（终浓度为 20ng/ml）、EGF（终浓度为20ng/ml）、胰岛素（25g/ml ）、葡萄糖（0.6%）、HEPES（5mM）、Glutamine（ 2mM）和N2的DMEM/F12），接种后7-9天传代一次。