原代神经细胞培养方法重点讲义资料
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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9
实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
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实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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1
☞ 主要内容 :
1
2
3
4
实验原理
原代神经细胞培养方法解析
神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项一、原代细胞培养原代细胞培养是指直接从生物体获取细胞进行培养的过程。
原代细胞更接近体内细胞的生理状态，因此在研究细胞的生理功能和疾病机制方面具有重要意义。
（一）取材1、选择合适的组织来源：根据研究目的选择健康的动物或人的组织，如肝脏、肾脏、心脏、皮肤等。
2、无菌操作：在取材过程中，要严格遵守无菌操作原则，使用无菌器械和试剂，避免微生物污染。
（二）组织处理1、清洗：将组织用无菌的生理盐水或 PBS 缓冲液反复冲洗，去除血液和杂质。
2、剪碎：将组织剪成小块，一般为 1-2mm³大小。
3、消化：根据组织的类型和特点，选择合适的消化酶，如胰蛋白酶、胶原酶等，在 37℃条件下进行消化，使细胞分散。
（三）细胞分离1、过滤：消化后的细胞悬液通过滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。
2、离心：过滤后的细胞悬液离心，去除上清液，收集细胞沉淀。
（四）培养1、接种：将细胞沉淀用培养基重悬，接种到培养瓶或培养皿中。
2、培养条件：根据细胞的类型和特点，选择合适的培养基和培养条件，如温度、CO₂浓度、湿度等。
一般来说，细胞培养的温度为37℃，CO₂浓度为 5%。
（五）原代细胞培养的注意事项1、取材要迅速，尽量减少组织在体外的停留时间，以保证细胞的活性。
2、无菌操作至关重要，任何一个环节的污染都可能导致培养失败。
3、消化酶的浓度和作用时间要适当，过度消化会损伤细胞，消化不足则细胞难以分散。
4、培养初期要密切观察细胞的生长状态，及时更换培养基，去除死细胞和细胞碎片。
二、传代培养当原代细胞生长到一定密度后，需要进行传代培养，以扩大细胞数量，维持细胞的生长状态。
（一）细胞准备1、观察细胞：在传代前，要观察细胞的生长状态，确定细胞是否达到传代的密度。
2、消化：根据细胞的类型和特点，选择合适的消化酶进行消化，使细胞从培养表面脱落。
（二）细胞收集1、离心：消化后的细胞悬液离心，收集细胞沉淀。
《原代细胞培养实验》PPT课件
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3
实验内容：
❖ 动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13 天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞， 成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎2-5个
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4
实验材料：
❖ 每组的超净台中有以下物品：
❖ 1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛 血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶； PBS(-)1 瓶
❖ 4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分 钟。
❖ 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮 细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照 每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活, 胰蛋白酶。
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❖ 6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组 织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。
3在无菌状态下将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离加入40ml025的无菌胰蛋白酶用搅拌棒轻轻搅动4在温暖的环境中或置于37c培养箱中轻轻摇动15分5让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶
❖ 2. 100ml灭菌烧杯2个；
❖ 3、50ml离心筒2个
❖ 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个
❖ 4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌 玻璃搅拌棒1个
❖ 5、细胞计数板1块；
❖ 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
❖ 7、酒精灯1台；
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试验操作步骤：
❖ 1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
神经元原代培养_
神经元原代培养_
神经元原代培养
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。
孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。
剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。
皮质碎片移到有0.025%胰酶的H BSS-2液中37°C消化15分钟。
胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/ mL庆大霉素）。
以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2湿温培养箱里进行培养。
每3天用吸管换液，一次换0.5mL。
体外培养8天细胞就能用于实验。
选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎组织的细胞连接还很少。
因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易发生损伤。
另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。
如果用的是乳鼠，一般是在培养36个小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。
另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、8天的、18天的细胞。
其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年的不同效应。
原代神经元培养培训课件
精品文档神经细胞原代培养的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在从动物（大鼠或小鼠等）培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等℃烘干，各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，60用酒精棉球擦拭后晾干，或经以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－小时以上消毒。
80％酒精浸泡1 器皿：1) 2) 3)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
5)培养瓶、盖玻片次，盐酸浸泡可用0.2N10分钟，用蒸馏水洗2培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，分钟，10分钟，再用双蒸水洗2次，每次1010每次分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
6)7)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
8)。
孔）、、、塑料培养板（35mm9)塑料培养皿（）62496精品文档．精品文档辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制多7-1400001) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为0.1mg/ml，浓度为。
聚赖氨酸（Poly-L-lysineNaCl主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于2) 平衡盐溶液：的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培3)无血清培养液。
养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27℃564) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需。
灭活30分钟）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补5) 冻℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml水至2.5%浓度，振荡摇匀，4。
原代细胞的培养和建系ppt课件
? 血液细胞的取材
? 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽 取静脉外周血，或从淋巴组织中（如 脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离 细胞，取材时应注意抗凝。
? 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材
? 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分 离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗 两次，再用培养液洗一次后即可培 养，不宜低温存放。
第四章 原代细胞的培养和建系
? 凡是来源于胚胎、组织器官及外周 血，经特殊分离方法制备而来的原 初培养的细胞称之为原代细胞。
? 凡是经传代方式进行再次培养的细 胞称为传代细胞。
? 若能稳定生长传至10-20代以上的细 胞可确立为细胞系。
? 单细胞经克隆、纯化并大量扩增所 形成的特性稳定的细胞群体称为细 胞株或克隆细胞。
? 剪切 ? 加液漂洗 ? 消化 ? 弃去消化液 ? 漂洗 ? 机械分散
? 消化分离法的注意事项
（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中 的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA 的抑制作用。
（2）胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不 能太长，以避免毒性作用。
（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液， 以避免毒性产生，而且动作要轻，以避 免膨松的细胞随漂洗而丢失。
2、幼鼠胚肾（或肺）取材
幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝 上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉 开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取 肺，或背部朝上固定在木板上，先将背 部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用 无菌法从背部打开腹腔取肾。
? 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材步骤 （1）取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，
pH=8.0 左右时最强 ? 酶的浓度 ? 温度 ? pH ? 无机盐离子，钙、镁等有抑制作用 ? 消化时间
? 胶原酶（collagenase）消化法
细胞原代培养PPT课件
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
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神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。
二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。
在体外，分离培养的神经节在NGF 存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。
1．材料和方法取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。
用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。
鸡胚背根神经节的取材方法同前。
剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。
置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。
24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。
接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2.培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L);10%胎牛血清; 10%马血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。
脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5 % 马血清；NGF 20ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3．新生大鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生大鼠背根节神经元接种后4h,大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形,直径8-14μm, 胞体周围呈现一圈光晕。
神经元的细胞核位于中央或偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。
接种后24h, 大部分贴壁细胞开始长出突起。
其中多数为具有多个突起的多极神经元,少数为双极和假单极神经元, 突起细长,并可观察到突起末端的生长锥。
除单个散布的神经元外,还常见到几个或多个神经元聚集在一起, 它们向四周发出树枝状的神经突起。
培养2-3d 后神经元的突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的神经网络。
随着培养时间的延长, 神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗,神经突起网络变得更加稠密, 神经元胞体逐渐增大。
大鼠背根节神经元可维持培养2个月。
4．新生小鼠背根节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠背根节神经元的形态结构和生长分化基本上与新生大鼠相似,但小鼠背根节神经元的胞体较大鼠稍小。
神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。
小鼠背根节神经元亦可维持培养2个月。
5．鸡胚背根节神经元的生长分化和形态特征鸡胚背根节神经元的生长分化基本上亦与新生大鼠和小鼠相似。
但鸡胚背根节神经元以假单极为多见。
与大鼠或小鼠背根节培养神经元相比,神经突起分枝较少。
神经元胞体稍小,神经元亦随着培养时间的延长而逐渐增大。
鸡胚背根节神经元亦可维持培养2个月。
三. 新生小鼠颈上交感神经元分散细胞培养交感神经系统在维持机体的正常功能和对环境的适应性反应中起着十分重要的作用。
交感神经细胞培养特别有助于神经细胞发育和可塑性研究，利用体外培养系统可进行交感神经细胞的发生、死亡、形态和生化发育、递质表形的获得，以及靶组织与传入纤维的突触形成的研究。
此外，通过体外培养系统可获得关于神经营养因子、激素，细胞因子等调节交感神经元发育的信息，了解传入纤维的输入以及与靶组织的联系的机制。
1．材料和方法实验用出生当天的昆明种小鼠，在无菌条件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖镊在解剖显微镜下找到气管两侧的颈总动脉,并以此为标志,在颈总动脉分为颈内外动脉交叉处找到上颈交感节, 取出上颈交感节, 置于含 1 % 胶元酶(Collagenase)和 1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)分散后，用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中，每皿2ml细胞悬液置。
置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。
24h后倾去培养皿内种植培养液,改用饲养(Feeding)培养液培养。
接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液,以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。
2．培养液成份种植培养液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L)；10%胎牛血清；10%马血清；NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。
脱氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
饲养培养液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,)；5%马血清； NGF20 ng/ml；神经营养素 1ml/100ml；谷氨酰胺100μg/ml。
3．新生小鼠交感节神经元的生长分化和形态特征新生小鼠交感节神经元在含 NGF 的培养液中种植后4h, 细胞即开始贴附在胶元薄膜或在皮层胶质细胞层上生长, 交感神经元的胞体一般为圆形, 有时亦可见椭圆或梭形,体积较大, 直径约8-14μm左右,胞体周围呈现一圈光晕,神经元的细胞核大多偏于胞体一侧,核仁明显,亦可见双核神经元。
接种后24h, 大部分贴壁神经元开始长出突起。
培养2-3天后,神经元突起逐渐增多并延长, 形成稀疏的网络。
随着培养时间的延长, 神经突起网络变得更加稠密。
神经细胞的主干和分枝明显延长并增粗, 神经元的胞体逐渐增大。
小鼠交感神经元可维持培养1-2个月。
四. 胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元培养，中枢神经系统包括脑和脊髓，脊髓是中枢的初级部分，其功能有二，一是传导感觉和运动冲动，二是完成躯体运动的基本反射。
脊髓突然被横断并与高级中级失去联系后产生脊休克。
因此，利用体外培养的脊髓腹角运动神经元进行脊髓损伤和修复的研究日益受到重视。
1．材料和方法用12-14d 胚龄的小鼠、12-14d 胚龄的大鼠、孵化10 d 的鸡胚，在无菌条件下取出胎鼠或鸡胚脊髓，剥除脊膜后,将整个脊髓腹侧面朝上置于平皿中，用微解剖镊和双面刀片沿脊髓中央管纵切两半，再将脊髓两侧的腹侧部分切下，将组织块切碎，用0.125% 胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后,用种植培养液(同第二节)稀释成5×105个细胞/ml密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml,置36℃、10%CO2的培养箱中培养,24h 后倾去培养皿内种植培养液, 改用饲养培养液(同第二节)进行培养。
以后每周换液两次,每次更换50%的新鲜饲养培养液。
2．胚胎小鼠、大鼠、鸡胚脊髓腹角运动神经元的生长分化和形态特征胚鼠和鸡胚脊髓腹侧神经元培养12h后,大部分神经元可贴壁,贴壁神经元呈圆形,直径5-8μm,其中少数神经元开始伸出1-2个突起。
培养24h后, 神经元突起逐渐增多并延长,形成稀疏的网络,培养的脊髓神经元以双极和多极为多见, 神经元呈圆形或椭圆形及多边形不等,胞核清楚,多数具1-2个核仁。
随着培养时间延长, 神经元突起进一步增多、增粗并延长,形成稀疏的神经网络, 神经元胞体逐渐增大。
多极胞体大的神经元逐渐增多,经胆碱乙酰转移酶（ChAT）免疫组织化学染色和乙酰胆碱酯酶(AChE)组化染色呈阳性反应。
此后，只要定期换液并适当抑制非神经细胞的过度增殖,胚眙大鼠、胚盼小鼠和鸡胚脊髓腹侧运动神经元在体外可维持培养2个月。
五. 新生大鼠海马神经元分散培养海马属大脑边缘系统，与情绪、学习及记忆有关，它具有明显的长突触传递的长时间程长时程增强（LTP）和长时程抑制（LDT）的能力。
LTP和LDP具有协动性、特异性、长时性的特点，目前已被认为是学习和记忆的基础。
而且海马组织常常是引起癫痫发作的病变部位，并且海马细胞对缺血、缺氧特别敏感。
这些特征反映了海马神经元的内在性。
例如，对缺氧的可塑性和易感性均与NMDA（N-methyi-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸）受体的独特性质相关。