原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!心肌细胞或肝细胞原代培养的方法在细胞培养中，心肌细胞和肝细胞的原代培养是研究这些细胞生物学特性的重要手段。
大鼠原代心肌细胞培养实验的
相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
心肌细胞分离与培养的教学内容与方法探讨
学内容 ， 提 高了教学质量和教学水平 。
△通讯作者 Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ： ｗ ａ ｎ ｇ ． ｓ ｈ ｉ ． ｊ ｉ ｅ ＠ｓ ｔ ｕ ． ｘ ｊ ｔ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
一
起 观察现象 ， 分 析原因 ， 寻找对策 。Ｂ组 学生的实验报告撰 写按 普通学 生实验 报告格 式进行 。（ ３ ） 评价： ①学生 评价 ， 口头
或 书面 ， 既指 出其优 点 ， 也指 出其不 足 ； ②教 师评价 ， 经 过综合 开放性 实验教 学培训 的学 生“ 科 研兴趣 提高 ” ， “ 积 极主 动性增 强” ， “ 动手能力更强”， “实验报 告撰 写内容更加丰 富、 规范” 等。（ ４ ） 困难 ： ① 缺乏 足够充分 的思想认识 ； ②适 当的管理模 式 ；
科研经验丰富 的教师 （ 主要是病理生理学专业 ） 组成 。（ ２ ） 实施 ： 将 １ ５ ０名本 科生先 按性别分 组 ， 再 根据随机 的原则将 男女学
生分别分配到 Ａ、 Ｂ两个实验组 ， Ａ组为综合开放性 实验 组（ ７ ５人 ） ， Ｂ组为验证性实验组 。Ａ组 学生在教师的指导下正确设计 实验 ， 并通过查 阅有关 文献 、 参考 资料 、 手册 、 工具书及其它信息源 获得 信息以解决实际问题 ， 当实验中遇到难题 ， 老师和他们
・
１ ９ｌ ７・
针 对 医 学本 科 生 的 综 合 开 放 性 实 验 教 学 实 践
汪 洋， 应 磊， 郝 卯林 ， 王 万铁
（ 温州医科大学病理生理学教研 室 ， 浙江 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
新生大鼠心肌细胞原代培养方法
（ ． ０ ９ Ｍ ｓ ｒ ｄ ｇｅ ａ ｄｄ ｔ ｏ Ｔａ ｊ ｎｖ ｒ ｔ ｏ Ｔ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉｅｅＭｅ ｉ ｎ ，ｉｎｉ ３ ０ ９ ： ． １ ２ ０ ａ ｔ — ｅｒｅＣ ｎ ｉａ ｆ ｉ ｉ Ｕ ｉｅｓ ｙ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌ ｈ ｓ ｄ ｉｅ Ｔ ａ ｊ ０ １ ３ ２ ｅ ｅ ｎｎ ｉ ｉ ｎ ｃ ｎ
原 代 心 肌 细 胞 培 养 技 术 被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾病 的研 究 之 中 ， 有 操 作 简 便 、 济 、 重 复 性 等 具 经 可
拘 。由天 津市 山川 红 实 验 动 物科 技 有 限 公 司 提供 ， 动物合 格证 号 ：０ ４ ３ 。 ０ ０ ０ ６
优点 ， 同时排 除 了神 经 、 液 等 因素 的干 扰 ， 可 从 体 并
Ｔａ ｉ ｉｅｓｔ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌＣ ｉｅｅ Ｍｅ ｉｉｅ Ｔ ａ ｉ ０ １ ３） ｉｎｉ Ｕｎｖ ｒｉ ｏ ａ ｉｏ ａ ｈｎ ｓ ｄｃｎ ， ｉｎｉ ３ ０ ９ ｎ ｙ Ｔ ｉ ｎ
【 ｓ ａｔ ０ｂｅｔ ｅ ｏｅｐｏｅｔｅｍ ｔｏｓ ｆｈ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ ａ ｉ ｙ ｓｆ ｅｓｃ ｉｇ Ａｂｔ ｃ】 ｒ ｊｃｉ Ｔ ｘｌｒ ｈ ｅ ｄ ｅｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｔ ０ ｔ ｕ ｋ ｖ ｈ ｏｔ ｉ ｕ ｃ ｄ ｃ ｅ ｒｈ ｎ
二、 实验 方法
１ 实 验动 物 ： ｄ内的 Ｗｉ ａ 新 生 大 鼠 ， 雄 不 ． ３ ｓｒ ｔ 雌
基 金 项 目 ： 家 自然 基 金 资助 项 目（ ｏ ８０ ２ ６ ） 国 Ｎ ． １７ ９ ５
作者单位 ：． １ 天津 中医药大学 ２０ ０ ９级硕士研究 生 ， 天津 ３０ ９ ； ． ０ １３ ２ 天 津 中医药大学 ， 天津 ３ ０ ９ ０ １３ 通讯作者 ： 张滕 ， ｍａ ：ａ．ｈｎｔｎ １３ ６ ．ｏ］ Ｅ ｉ ａａ ｚａｇ ｇ２ ＠１ ３ ｃｎ ｌ ｅ
原代心肌细胞培养
原代心肌细胞培养曾石秀;廖伟【摘要】目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】3页(P167-169)【关键词】原代心肌细胞;培养;存活率;纯度【作者】曾石秀;廖伟【作者单位】南昌大学医学院,江西南昌330000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1原代细胞培养是分子生物学和细胞生物学研究的一项基本技术。
原代心肌细胞可保存其结构和功能上的某些特点，有自发性搏动，不受神经、体液因素的干扰，有利于直接进行生理、病理及药理等多方面的研究［1］。
本研究目的为探讨一种实用的原代心肌细胞培养方法。
1 材料与方法1.1 实验试剂与配制高糖DMEM、胰蛋白酶(Gibco 公司)，Ⅱ型胶原酶、BrdU(5-溴-2＇-脱氧尿苷)、0.4%台盼蓝(Sigma公司)、胎牛血清(Hyclone公司)，α横纹肌肌动蛋白(α-SA)单克隆抗体、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)。
1.2 实验动物出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，雌雄不限［清洁级，江西中医学院，许可证号 SCXK(赣)2010-0001］。
1.3 实验仪器超净工作台(上海博迅公司，型号SW-CJ-2FD)、CO2培养箱(Thermo公司，型号Forma311)、低速离心机(江苏环宇公司，型号80-2型)、高精度恒温水浴箱(上海博迅公司，型号SSW-600-2S)、倒置相差显微镜(Olympus公司，型号CKX 41)等。
2021简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法范文3
2021简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法范文 引言 原代心肌细胞培养是一项重要的体外实验技术，其为建造心血管疾病发生发展过程的模型及探讨基因、蛋白质及信号通路的变化提供重要的基础保障。
此外，在体内心肌细胞的活动受到神经、体液等多方因素的影响，限制对其病理变化的过程的研究。
而体外培养的原代心肌细胞不仅具有心肌细胞固有的活性，而且还有不受神经、体液等因素的影响的可控制性。
因此，原代心肌细胞培养的好坏，是影响实验的结果的关键因素之一。
本研究通过比较不同消化时间对原代心肌细胞的影响，探讨一套简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法。
1材料与方法 1.1 实验动物选择出生 1 ~ 2 d 的 Wistar 大鼠，清洁级，雌雄不限，由内蒙古大学动物研究中心提供，合格证编号： csxk（蒙） 2002-0001.杨木小刨花垫窝，湿度 45% ~50%,温度控制在 21 ~27 ℃。
1.2 主要试剂及仪器 DMEM 高糖培养基（含 100U 青霉素 + 链霉素双抗）、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶（ Worthington 公司，美国）、磷酸盐缓冲液（ PBS）、台盼蓝染色液； 5-溴-2-脱氧尿苷（ Brdu）、4% 多聚甲醛、过氧化酶阻断溶液、羊血清、α-actin抗体（兔抗大鼠）、二氨基联苯胺（ 3,3'-diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒、SABC（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法）免疫组化试剂盒、Mayor's 苏木精、二甲苯、TritonX. 100（生工生物工程有限公司，中国）、37 ℃恒温浴锅、医用超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、恒温离心机等。
1.3 实验步骤①将大鼠浸没在 75% 乙醇中消毒2 次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左侧剪开，压住肺叶，心脏收缩时可见其膨出。
眼科镊钝性分离下心脏，放入有10 mL 10% DMEM培养基（含双抗）的培养皿中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
心肌细胞的分离及培养器械：饭盒、烧杯、弯头解剖剪（2）、小镊子（2）、平皿（4）、毛玻片、滤网、离心管（15ml）、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒溶液：PBS、DMEM（含血清）、DMEM（free）、胰酶动物：小鼠准备：用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束，提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。
培养过程：1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液，将小鼠浸入70％酒精<5min，用小剪子及小镊子开胸取心。
2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及纤维组织。
3、PBS再冲洗后，转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中，用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块，倒入15ml离心管中，加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。
4、放入水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。
5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管，吸管轻轻吹打1min，消化10min，小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中，细胞悬液离心，1000转×10min，弃上清，加培养基为管1。
6、重复第5步，3-8次，直至至组织块消化为止。
7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤，混合。
8、加入1ml DMEM重悬，显微镜下观察并计数。
9、培养1-1.5小时，收集培养液中的非贴壁细胞，小心不要晃动。
10、显微镜观察并计数，细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。
11、4-6小时后，用培养基轻轻冲洗2次，加入培养基继续孵育过夜。
或从第5步起，加胰酶10-15ml，30min 37℃水浴，每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。
原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。
采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。
结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。
表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。
关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠Explore a method of neonatal rat myocardial cells in cultureZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, ChinaAbstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity.Key words Myocardial Cells; Culture; Rat随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。
1材料与方法1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。
每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰蛋白酶液加入含有0.1mmol/L Brdu培养液5～10ml在标记处反复吹打，计数板计数细胞5×105/ml，根据需要传至培养瓶（板）中培养，多数3～4天后长成致密单层可用于实验。
1.2 培养心肌细胞的鉴定1.2.1 心肌细胞形态观察常规倒置显微镜观察细胞形态变化、心肌细胞搏动情况，并随时用Leica DMIRB Microsystems记录（Leica, 德国）；取培养心肌细胞单层飞片行苏木素－伊红染色（HE染色）后，光学显微镜下观察并照片。
培养细胞用0.1％胰蛋白酶消化后，离心，沉淀固定，送电镜室制片，透射电镜观察并摄片。
1.2.2 细胞成活率的测定取细胞悬液，并作适当稀释106/ml，按9:1加入0.4％台盼篮溶液混匀，显微镜下用计数器计数活细胞和死细胞。
1.2.3 鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（HHF35）的检测采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连接法（Streptavidin peroxidase conjunction method, 简称S-P法）。
具体步骤如下：单层细胞飞片清洗后95％酒精固定30min；PBS洗5min×3，滴加3％H2O2室温孵育10min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10min；滴加适当比例的一抗工作液，37℃孵育4℃过夜；PBS冲洗，5min×3，滴加生物素标记二抗工作液，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3，滴加新鲜配制的DAB显色液显色5～10min；苏木素复染5～7min，1%稀盐酸分化1min，自来水返蓝；酒精剃度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并摄片。
2 结果2.1 心肌细胞形态倒置显微镜下可见传代细胞未贴壁呈圆形，贴壁后生长逐渐呈梭形、多角形，胞核1～2个、呈圆形、具有1～2清晰的核仁，细胞大小均匀，生长迅速，单个细胞自行蠕动，当生长成片后可见呈岛屿状搏动，搏动频率130～150次/分。
培养心肌细胞HE染色细胞形态饱满、细胞膜完整；透射电镜观察细胞完整，胞膜皱褶整齐，细胞中肌丝、线粒体清晰、分布均匀，细胞核完整。
（图1～3）2.2 心肌细胞成活率测定计数500个细胞，27个染色阳性，成活率94.6％。
2.3 肌动蛋白免疫细胞化学反应镜下观察肌动蛋白HHF35经S-P法培养的心肌细胞胞浆呈现深浅不一的棕褐色阳性表达，任选5张飞片，分别计数100个细胞，阳性细胞达96.4％（图4）；而用PBS代替一抗其结果均为阴性。
3 讨论构成心脏的细胞中约有80％为心肌细胞外，还有主要为成纤维细胞等非心肌细胞，本实验所取组织块尽量细小外，并一定要冲洗干净，放入培养瓶内时培养液不要过多易于贴壁，翻转瓶时间不要过长避免干涸，采用此种方法主要是便于心肌细胞迅速贴壁生长，培养液中加入Brdu抑制成纤维细胞DNA合成达到抑制增生的目的[1]；传代时先吹去组织块，然后依据心肌细胞的特性，快消化、轻消化，可看到细胞形态小的心肌细胞变圆，而细胞形态大的成纤维细胞仍伸展，立即中止消化迅速传代，仍用含有Brdu的培养液培养，3～4天后细胞形成致密单层即可进行实验。
此种方法培养的细胞可能与含有少量成纤维细胞促进心肌细胞贴壁和生长，有研究报道[2]成纤维细胞条件培养液有提高心肌细胞贴壁率及搏动率的作用，表明有促进心肌细胞搏动和生长的因子，也提示成纤维细胞与心肌细胞间可能存在着某种信号联系。
我们也观察到培养的心肌细胞成片搏动长达20多天。
心肌细胞搏动表明具有自律性的心肌细胞活性和状态良好；心肌细胞HE染色观察形态和贴壁情况；透射电镜观察可观察心肌细胞的超微结构肌丝和线粒体活性等[3]；对台盼蓝摄取反映细胞膜损伤和细胞死亡；肌动蛋白HHF35免疫细胞化学反映在细胞浆中阳性表达，可间接反映心肌细胞纯度。
通过反复实验我们体会到：①要选择24h内的新生鼠，而以12h内培养效果最佳。
②严格无菌操作，打开胸腔后迅速摘取跳动的心脏，操作要熟练快捷。
③细胞贴壁生长成致密单层后尽早进行实验，否则会降低心肌细胞的纯度，不利于对单纯心肌细胞的研究。
④传代消化时胰蛋白酶浓度不要过高，时间不要过长，最好在显微镜下观察，以免较牢贴壁的非心肌细胞浮起。
⑤选用飞片要薄，要紧贴培养瓶（板）不要留有气泡，可滴加少许培养液后再放置飞片。
⑥要注意培养液的稳定性，适量的血清浓度，适宜的pH。
只有这样才能培养出生长迅速、纯度高、活性好的心肌细胞。