乳鼠心肌细胞培养详细步骤
小鼠乳鼠培养方法 Microsoft Word 文档
小鼠乳鼠心肌细胞培养物品：手术器械（眼科剪2把、眼科镊2把、手术镊1把）、培养皿4个、小烧杯2个、离心管4个、200目筛网、6孔板、垃圾桶、一次性吸管、加液枪（配各型号枪头）、75%酒精试剂：D-Hanks液2瓶（其中一瓶在操作前37℃预热）、2.5％胰酶消化液、加有FBS（浓度为10％）的DMEM培养基、Brdu、1％明胶、0.4％台盼蓝液操作程序：1、将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管、200目筛网）进行高压灭菌2、用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒30分钟3、将1％明胶加入六孔板中（每孔1ml）4、用镊子夹住小鼠颈部将小鼠在酒精中浸泡两次，每次2-3秒5、将消毒后的小鼠放入培养皿中，用剪刀将小鼠头部剪去，并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下放入装有预冷的D-Hanks液的培养皿中，将心脏剪开清洗残留的血液。
6、将心肌组织转移至另一个装有预冷的D-Hanks液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的2.5％胰酶。
7、将心肌组织转移至离心管中，反复吹打10min,静置2min后，弃上清。
8、再次加入D-Hanks液和等体积的2.5％胰酶，常温下反复吹打10min，静置2min后将上层液转移至100ml容器中，加入含10%FBS的M199培养基或DMEM培养基终止消化9、重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间10、用200目筛网过滤得到细胞混悬液，转移至10ml离心管。
11、以300g室温离心5min12、弃去上清后加入DMEM+Brdu培养基吹打，转移至50ml培养瓶中后放入37℃ 5% CO2培养箱进行差速贴壁1h13、将六孔板中的明胶吸出14、计数心肌细胞15、按六孔板细胞数（4~5×105个/每孔）加入细胞悬液，并添加M199+Brdu培养基或DMEM+Brdu培养基至3ml16、至置培养箱37℃5% CO2培养箱培养。
17、24h后换液，培养基改用不含5-BdrU的培养基继续观察培养。
乳鼠心肌细胞分离及培养程序
下文所述程序改编于Speicher和McCarl（1974）的方法。
实验需要两把弯头的解剖剪，两把5号钳子，一个25-ml的带橡皮塞的锥形瓶，内装一搅拌棒。
所有器械使用前均应消毒灭菌。
为了进一步保证无菌条件，最好用一次性无菌塑料用品。
所有的孵育操作均应在高湿度的5% CO237℃孵箱中。
本实验适合处理20~30只幼鼠，若少于20只鼠则可能会发生组织消化过度的情况，若超过30只，则由于准备工作加长降低了细胞的成活性。
组织消化和分离细胞1）在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有100-ml灭菌水的容量600-ml的烧杯，加热至37℃。
2）准备胰酶液。
用水浴或温箱使胰酶液温度保持在37℃。
胰酶（0.1）%，100ml盐水A 90ml1%胰酶1:300（GIBCO/BRL）10ml使用当天配制盐水A137mmol/L NaCl4 mmol/L KCl4.2 mmol/L NaHCO35 mmol/L 葡萄糖溶于无菌蒸馏水中3）做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70%乙醇擦拭平皿后放进操作台。
取3个60-mm的一次性组织培养用平皿，加入5 ml盐水A，标记上1，2，3，放进操作台的冰台上。
4）取一只干净加盖的烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把0~1日龄的SD幼鼠放进该烧杯中麻醉。
20只幼鼠大约需要5分钟时间。
用70%乙醇擦净烧杯再放进操作间。
5）一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。
用乙醇擦洗其胸部及腹部。
把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着1的培养皿中。
24-mm规格的弯头解剖刀适合用于切口及摘除心脏。
此时幼鼠心脏仍能跳动，故一般很容易找到并摘除。
可用同一把解剖刀将心脏摘出放进盐水A溶液，若需要也可用灭菌的5号钳子。
6）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。
每次解剖约需1分钟。
7）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
㈠、概述 整体动物⼼肌细胞的增殖能⼒在出⽣后仅能维持⼀个短时期，⼩⿏在出⽣3周后DNA合成所需的酶的活性及⼼肌细胞的增殖能⼒就明显降低⾄成年⿏⽔平。
⼩⿏⼼肌细胞的原代培养，⼀般选⽤⽣后1-10d的乳⿏⼼脏，尤以出⽣1-4d的较好，此时⼼肌细胞已分化充分，适于作各种研究，⽽出⽣4d以后的乳⿏⼼脏中分离出来的⼼肌细胞较慢发育成为有⾃律性搏动的⼼肌细胞。
㈡、[试剂] 1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%⼩⽜⾎清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100µg/ml 链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原酶II（活⼒为150U/mg） 0.05% ，⽤pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
3、 D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g ， KH2PO4 0.06 g ， NaCl 8.00g ， NaHCO3 0.35 g ， Na 2HPO4？7H2O 0.09 g ，酚红 0.01 g 1L ㈢、[实验步骤] 1、取⽣后1-4d的乳⿏，⽤75%⼄醇消毒⽪肤，再⽤⼤头针固定乳⿏的头及四肢，剪开胸部⽪肤，⽤75%⼄醇消毒⽪下组织，更换镊⼦及剪⼑，开胸取出⼼脏，将⼼脏放⼊盛有D-Hanks溶液的平⽫（或青霉素瓶）中，剪去⼼房，剪开⼼室，⽤D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积⾎后，将⼼脏剪成1mm3 ⼤⼩的碎⽚，再将⼼脏碎⽚转移⾄离⼼管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，⾃然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇⼏下），⽤吸管吹打1min 后，将未消化完全的⼼脏碎⽚吸出⾄另⼀离⼼管中，加⼊2ml冷的培养液终⽌消化，1000 rpm 5min ，弃上清，沉淀中加⼊D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，弃上清，沉淀中加⼊培养液2ml，⽤吸管吹打制成细胞悬液。
乳鼠原代心肌细胞培养方法
乳鼠原代心肌细胞培养方法
实验动物
出生1~3天的健康乳鼠（Wistar），雌雄不分。
药品与试剂
DMEM/F12基础培基，Brdu ，胰蛋白酶（1:250），Ⅱ型胶原酶（sigma)，胎牛血清（hyclone），双抗（青霉素-链霉素）
原代心肌细胞培养
1．出生后1~3天的乳鼠，雌雄不分。
将乳鼠在75%乙醇中浸泡5秒左右，于无菌条件下取出心脏，置于平皿中，用PBS溶液反复洗涤3次，并除去大血管及脂肪组织，眼科剪剪碎至约1mm3。
2．用0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.06%的胰蛋白酶在37℃恒温摇床中震荡消化5~7次，每次5min。
收集除第一次之外各次所得的消化液，并及时加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。
（第一次的消化液中含较多血细胞，故弃去，也可视清洗的情况而定）
3．终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块，1000rpm离心10min 收集细胞。
4．离心后弃上清，用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，CO2培养箱差速贴壁1.5小时。
5．收集未贴壁的细胞悬液，重新接种于培养瓶中，前3天加用0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞的生长。
6．培养2~3天，待贴壁心肌细胞连成片状同步搏动后，消化接种于不同的培养板中，供进一步实验用。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
心肌细胞培养
原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。
然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。
细胞计
2
条件下培养。
于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。
细胞培养72h后用于实验。
乳鼠心肌细胞分离
Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol作成者：富海英 趙卉日 期：2006/08/11法消毒器具：镊子 大和小 各两把，用纸包好后放入一个玻璃杯中放入搅拌棒的50cc 的烧杯一个次日开始培养的话，提前：17～21時）１）Hanks medium 15ml 加入P10培养皿，共三枚，置于37℃ incubate（其中2枚在取心脏时备用）Hanks medium 是室温保存，没时间的话，不用incubate 37℃也可２）从新生大鼠取心脏（以下以两窝计算）铺上草纸、准备酒精消毒液和尸体袋取出心脏（从剑突左下用尖镊子刺入，分离，心脏将突出体外）用镊子把心脏夹出，放在P10培养皿中将全部大鼠的心脏取出后，把心脏移到新的培养皿中然后拿到无菌操作台（cleanbench ）里面行进一步操作３）将P10 dish 中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿，枚目のdish に移将心脏撕裂2-3下，裂而不断的程度即可。
４）将Trypsin/EDTA 放入50cc 三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml 。
4℃ 过夜。
Trypsin 不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出，将需用部分取出注入带刻度试管中。
Trypsin 不要加热，以免影响效果。
4℃过夜，静置即可。
12-16h后：早上9点开始）试剂：D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG)FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M)PSG (GIBCO Cat No. 10378-016)GIBCO Hank’s balanced salt solution（Cat. No. 14175-095）（不含Ca,Mg离子）Collagenase Type II （Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2）最终浓度0.5~1.0mg/mlBSA (Sigma)最终浓度5mg/ml0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO、cat No. 25200）（4℃直接使用，不加温）５）配制胶原消化液：Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml６）在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM（10%FCS）10ml，37℃恒温槽5min７）弃上清，加胶原消化液10ml（0.22um filter过滤）（弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。
乳鼠心肌细胞的培养ppt课件
实 验 目 的 意 义 实 验 材 料
实 验 方 法
操作步骤及人员落实 预 期 结 果
目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培 养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的 观察方法。 意义：原代培养是指直接从机体取出细胞、组织 和器官后立即置于培养基中培养，使细胞得以生 存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，细 胞保持体内原有的基本性质，适用于研究。 一般说来，幼稚状态的组织和细胞（如动物的胚 胎、幼仔的脏器）等更容易进行原代培养。
•消 化 组 织
•培 养 细 胞
前 期 准 备
1. 将备用物品（手术 器械、培养皿、烧 杯、离心管等）进 行高压灭菌； 2. 用酒精擦拭层流台， 将高压灭菌后的物 品放入层流台，紫 外线消毒30分钟。
用镊子夹住小鼠尾巴将小 鼠在酒精中浸泡两次，约 2~3秒； 2. 用剪刀将小鼠头部剪去； 3. 将动物固取材器官范围的 被毛，定在解剖板上并将 胸部剪开暴露出心脏，用 另一个剪刀将小鼠心脏剪 下； 4. 放入装有预冷的Hanks液的 培养皿中，将心脏剪开,剪 碎组织至1mm³左右，清洗 残留的血液。
1.
1. 将心肌组织转移至另一个装有预冷的Hanks液的培 养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的0.125％ 胰酶； 2. 将心肌组织转移至离心管中，用吸管反复吹打（使 消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来）10min, 静置2min后，弃上清； 3. 再次加入Hanks液和等体积的0.125％胰酶，常温下 用吸管反复吹打10min，静置2min后将上层液转移 至100ml容器中，加入含10%小牛血清的1640培养 基终止消化； 4. 重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间。
仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、
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乳鼠心肌细胞培养
物品准备
眼科剪、眼科镊、泡沫板、75%酒精、细胞培养皿、细胞培养瓶、胰蛋白酶、胶原酶II、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、离心机、温控水平摇床、二氧化碳培养箱、普通倒置显微镜、细胞计数板、胎牛血清、DMEM培养基、生理盐水、细胞过滤器、除菌过滤器、15ml离心管、50ml离心管
试液配制
（1）培养液A:按每90ml培养液加入10ml胎牛血清即为10%DMEM培养液（含双抗）。
（2）培养液B:含0.1mmol/LBrdU配制的DMEM高糖型培养液（含双抗）。
（3）消化液：0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ型分装冻存于-20C。
将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。
操作步骤
（1）取1-3天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上;
（2）应用75%酒精常规消毒;
（3）从左侧肋下缘剪开胸腔,用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中;
（4）全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中;
（5）剪碎，用无血清培养液洗1-2遍后，转移入50ml离心管中;
（6）加入10ml 消化液，放入37℃摇床 100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。
（7）沉淀的心室组织中加入10ml消化液，37℃摇床 100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于 20ml 培养液中。
（8）重复 5-6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。
用200μm 筛网过滤，1000rpm，4℃，离心 8min。
（9）用培养液A将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入 5%CO2 恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。
（10）将T25培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25培养瓶，放入细胞培养箱培养 1h，进行第二次差速贴壁。
（11）收集上清并计数后，离心 1000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。
（12）用培养基B重悬细胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的细胞密度接种于六孔板中，放入细胞培养箱培养。
同时，取200μl未接种的细胞悬液进行细胞存活率检测。
（13）细胞培养24h 后给予培养基B换液，前3天每天使用培养基B换液培养，以后使用培养基 A（即不加 BrdU）常规培养。
心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。
注意事项
（1）心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占50%。
决定心肌细胞培养成败的关键是:1)不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。
2 )尽量减少非心肌细胞的存在。
为了获得纯化的心肌细胞，可以采取差速贴壁及应用DNA抑制剂等办法。
因心肌细胞需12-15h后才开始粘附并伸展，而其它非心肌细胞包括内皮细胞、平滑肌
细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血细胞等贴壁较快，因此通过差速贴壁可以去除大部分非心肌细胞;应用5-溴脱氧尿苷，可以杀灭所有的分裂细胞。
除了以上措施外，以下几点也须往意: 1 )要尽量使用刚出生的乳鼠; 2)要尽量去除心房及周围血管组织; 3) 培养液所含血清浓度不宜过高，以6-10%为宜，血清易促进非心肌细胞的生长。
（2）心肌细胞的鉴定主要通过形态观察及免疫组化染色。
相差显微镜下心肌细胞呈多角形伸展，中间较厚，可自然搏动;心肌细胞汇合后，可出现同步性搏动。
（3）心肌细胞分离的关键问题是胰酶的浓度。
浓度太高，细胞受到损伤，破裂，碎片增多，浓度太低心肌细胞不易分离下来。
-般用1:250的粗制胰酶，0.05-0.1%的浓度即可。