心肌细胞培养
心肌细胞纯化培养方案——帝沃生物
来源不同，操作人员熟练程度不同，本方案试剂各添加量仅供参考； 4. 本实验最终纯化获取的原代心肌细胞，观察其调动频率、调动幅度以及波峰与波谷时间
间隔等参数值，所使用的设备为 RTCA Cardio(细胞实时无标记多功能分析仪)，如若使 用其他设备检测数据，所获取的数据值参考单位可能与本实验方案有不同，请注意分辨。 5. 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II，都是用 Hanks 液配，是现配现用，直接粉末配制， 分别称好所需的质量，同时溶于 HBSS 中，微孔过滤待用。整个消化过程用的都是此消 化液，即 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II 溶于 HBSS 中配制而成。实验前，称量所需 的胰蛋白酶和胶原酶 II，分别称量好后，放在一起，溶于 HBSS 中，用注射器接上 0.22um 的微孔过滤器，过滤消化液，放入超净台中备用。 6. 本实验方案仅供技术交流之用，实验方案提供者不承担以此实验方案发生的一切事故责 任。
注意：心肌细胞头 2-3 天会抱团，一个集落一个集落地跳，3 天后会慢慢铺开，表现为细
胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第 4-5 天时可以看到成片跳动，如果种的密度低， 就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。一般心肌细胞种在塑料基底的培 养皿或培养瓶中，合适的细胞密度下心肌细胞可以从第 2-3 天开始跳动，大约持续到第 4-7 天的，或许更长的时间，而在玻璃基底上（明胶包被）种的细胞有时也能坚持到 7 天，一般 都坚持不了。细胞不聚成一片，细胞纯度可能不够，成纤维细胞等较多，细胞难以连接；心 肌细胞密度较低；细胞的生长状态不好，受到支原体或环境条件的抑制；培养基和血清是否 合适（我们常用 Gibco 10% FBS+Hyclone DMEM），或者这两者存在一些问题，这都是有可 能的。
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
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大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
原代心肌细胞培养
1 材料1.1动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
1.2 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。
培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
1.3 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
2 方法2.1 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2.2 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
2.3 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
心肌细胞
心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。
[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。
其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。
平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。
消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。
抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。
[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。
2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。
将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。
3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。
后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。
改进原代心肌细胞培养
一、器材及试剂准备1、4个烧杯（1个装棉球及酒精，1个装大鼠，2个用于盛75%酒精），离心管架，冰袋；2、消毒用具：（1）高压饭盒内装：棉球、3把小剪子（1把剪皮肤，1把剪肋骨，1把用于剪碎心脏）、2把镊子（大镊子用于夹取灭菌后的器具，小镊子用于夹取心脏等）、玻璃离心管、培养皿等；（2）玻璃吸管；3、试剂：（1）过滤除菌的D-Hanks液；（2）含10%胎牛血清的DMEM；（有的用小牛血清，因为其营养成分少，可抑制纤维细胞的生长）（3）不含EDTA的0.125%胰酶；（4）0.08%的胶原酶II；（5）10mmol/L的储存液BrdU（需避光保存）,使用时需要以1:100的浓度稀释，直接加入培养瓶中；（6）75%酒精。
二、细胞培养（15只大鼠）1、将棉球放入含有75%酒精的烧杯，将完全培养基倒入玻璃培养皿中，置于冰袋上；2、将饭盒打开，将饭盒盖里面朝上放置，用已用紫外照过的大镊子取出2把剪子，1把镊子，沿着饭盒盖摆好备用，用大镊子将离心管夹出放在架子上备用；3、用大镊子将小鼠从垫料中取出，放入盛有75%的酒精缸I中，10s,取出，放入另一个盛有75%的酒精缸II 中，10s,取出；4、取出一个用酒精浸泡过的棉球，垫于大鼠腹部，以防取心脏时手套被血污染；5、左手食指和中指夹住小鼠头部，拇指夹住其右上肢，无名指和小指夹住其下腹部，剪刀I从剑突下沿胸骨剪开皮肤，再用剪刀II剪开肋骨，可见心脏蹦出，用镊子将心脏夹出，放入含有血清的DMEM中，用镊子将心脏中的血挤出（每处理完一只大鼠，均要用酒精棉球将剪子和镊子擦干净）；6、将心脏全取出，挤完血后，将培养基吸出弃去，加入无血清DMEM，并用剪刀II及镊子将心房和血管除去；7、将无血清DMEM及心房和血管组织吸净，用剪刀III将心脏剪成碎，成泥状；8、用0.125%的胰酶4ml吹悬剪碎的心脏组织（可逐步加至4ml，15只大鼠用4ml胰酶），并将之移到离心管中；9、水浴：将离心管放到水浴锅中，振荡5min,弃上清；10、再向离心管中加入3.5ml的胰酶（胰酶用量逐渐减少，防止细胞过度消化），振荡水浴10min，将上清和沉淀分别吸出，分别放到两个新的离心管中; （丝状的物质内含有丰富的细胞，应将它放入盛细胞的离心管中）11、向有细胞的离心管中加入含有血清的DMEM终止消化，向有沉淀的离心管加入3ml的胰酶，继续水浴10min，将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中；12、将胰酶的量减至3ml，重复步骤10-11;13、向含有沉淀的离心管中加入2.5ml胰酶+2.5ml胶原酶II，水浴消化10min，将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中;14、向有细胞的离心管中加入含有血清的DMEM终止消化，向有沉淀的离心管加入2ml的胰酶+2ml胶原酶II，继续水浴10min，将上清和沉淀分别吸出，放到两个新的离心管中；15、重复步骤14-15，共计消化8次；（理想状态：无肉眼可见的组织块，每次水浴后可见上清浑浊，吸取时可见丝状物）16、将含有细胞的离心管离心，1000rpm*10min;17、将每个离心管中的白色块状沉淀以及漂浮着的丝状物吸出，放入一个新的试管中，加入适量含有血清的DMEM，吹悬细胞，并将之种到培养瓶或培养皿中，以1:100的比例加入10mmol/L的BrdU抑制心肌细胞的生长。
心肌细胞培养
原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。
然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。
细胞计
2
条件下培养。
于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。
细胞培养72h后用于实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
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乳鼠心肌细胞培养经验谈
1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：
胰酶＋胶原酶II混合消化的方法，并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。
还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2.5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。
经验一：
总结来说：
1.0.08％胶原酶II＋0.125%胰酶等比混合后消化
2.消化前后一定要轻柔吹打
3.重悬时要充分吹打，动作轻柔（100次）
4.种板密度要合适
5.当然血清，板都要进口，别图便宜
6.别忘了检查CO2温箱的情况
2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：
胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧，或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。
经验二：
1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的，活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的，再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。
2:胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了,处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5%血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。
离心1000转4分钟.
3:四季清的胎牛血清,180元一瓶,很便宜,进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱,我建议用进口的.我们用的是15%的浓度.(注意:终止液和培养液浓度是不同的,终止液没必要用那么高浓度,有点浪费),我们用高糖的DMEM,感觉不错.在这里我感觉最重要的培养液的PH值,尽量在7.2-7.4之间,刚开始我们还有仪器测,后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调,大部是高,没有低的.所以NAOH没有用过.
4:离心管和瓶最好是用进口的,还要差速贴壁.细胞接种的浓度最好高些,宁可浪费一些.也不要让浓度太低,低了不容易活.这个本人觉得可能是细胞之间会产生某些刺激生长的东西,再说了,不管浓度高低肯定会有一些死细胞存在的,死的细胞对活细胞的生长也是有害的,所以尽量接种浓度要高些。
心肌细胞培养最好的培养基相关问题讨论总结
乳鼠心肌细胞培养培养基可以用EMEM,MEM,DMEM,M199,MCDB107液,DMEM/F12液，其中以DMEM/F12液最佳，ph值为7.2-7.4。
DMEM/F12养原代心肌，依赖于开始养的细胞状态。
DMEM/F12可能开始会使细胞状态可以，提前拨动，但也会让细胞提前老化，所以很难控制最佳状态，提高血清会提高细胞的贴壁率，当然也会带来成纤维的干扰，事实上有点成纤维，心肌会长的更好。
HG-dmem+10%FBS养，感觉状态比较好控制，次日下午就可以看到跳动，第三天同步搏动就可以开展实验了，之后细胞呈老态化，数目减少，成聚，个个像个会搏动的向日葵。
原代心肌细胞培养（不用胶原酶并且消化次数不多）
主要用品：
WISTAR乳鼠,出生2天6只
一把弯摄，两把剪子，200目滤网，康宁塑料培养瓶，冰台
高糖DMDM（HYCLONE），四季青胎牛血清（10%），sigma胰酶（1：250，0.25%,PBS 配制，PH约7.0)，国产BRDU
1.用洒精棉擦干净乳鼠后拿入超净台，再将鼠放入洒精中泡几秒后拿出，用眼科剪在胸骨左侧约第6肋间剪开胸骨（不要剪开腹腔），心脏可跳出，在收缩时剪下，放入含预冷的PBS 平皿内（置于冰台上），用洒精棉擦净剪子上的血迹过火后处理下一只。
2.剪除心脏上的大血管心房部分，将心室肌移入另一装有预冷PBS的平皿内，每个心脏剪成两半，在PBS里洗干净，移入另一小烧杯内，剪成0.5-1mm3小块，PBS冲洗3次
3.加入预热胰酶5ML，转移入50毫升离心管内，用3ML一次性吸管（短粗口的）软柔吹打2-3次，放入37度培养箱（无CO2）中，每2分钟振摇一次，5分钟后拿出，在超净台内吹打100次，沉淀一会后弃上清
4.再加入5ML胰酶置离心管内，重复步骤3，将此次上清放入预先分装的5ML完全培养基（10%FBS高糖DMEM），吸管吹打液体100次充分混均而且带入的少量组织块也可分散，放入4度冰箱中，（除第一次弃上清外，再消化3-4次便可消化完全）
5.将收集的上清液于200目滤网过滤后离心（1100转5MIN，离心机半径约15CM），重悬，分2个25CM2的培养瓶中，差速贴1.5小时，用瓶内的培养液轻轻吹瓶壁2次，转移到另外2个培养瓶内，加5-BRDU（终浓度0.1MMOL/L）
6.48小时换液,可同步搏动，（只有细胞之间可以连接的时候才会同步搏动，细胞数少时就自已跳自己的）
小结：
1.消化非常关键，时间不可太长，胰酶浓度我用0.1,0.2%时消化次数太多，细胞活力不好。
消化后的吹打是消化次数减少的关键，吹打完的上清一定要快速转移，否则会消化过度。
2.消化时要用底大点的容器，我用过15ML的离心管，组织都堆在管底了，摇都摇不动
3.冰台，可以保证细胞活力
4.消化后会有胶状物连着组织块，上清不易吸出，可以先把这种东西吸出，管里就剩上清了。
5.离心机的转数，文献上多少的都有，但是都没提半径是多少，一般离细胞200-300G。
原代心肌细胞培养技巧
1新生大鼠鼠龄的选择
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。
2消化酶的选择及使用
新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g/L,我们使用的为0.8 g/L.胶原酶最好现用现配.
3消化程度的把握
新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增
加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.
4接种的细胞密度
心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.
5细胞的分散度与接种的均匀性
分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外,可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.
6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.
7换液时间
进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g/LBSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.
8抗污染措施
除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.
9培养液pH值
适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：
(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.
(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.
(3)应及时换液.
(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。