心肌细胞培养
心肌细胞纯化培养方案——帝沃生物
来源不同，操作人员熟练程度不同，本方案试剂各添加量仅供参考； 4. 本实验最终纯化获取的原代心肌细胞，观察其调动频率、调动幅度以及波峰与波谷时间
间隔等参数值，所使用的设备为 RTCA Cardio(细胞实时无标记多功能分析仪)，如若使 用其他设备检测数据，所获取的数据值参考单位可能与本实验方案有不同，请注意分辨。 5. 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II，都是用 Hanks 液配，是现配现用，直接粉末配制， 分别称好所需的质量，同时溶于 HBSS 中，微孔过滤待用。整个消化过程用的都是此消 化液，即 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II 溶于 HBSS 中配制而成。实验前，称量所需 的胰蛋白酶和胶原酶 II，分别称量好后，放在一起，溶于 HBSS 中，用注射器接上 0.22um 的微孔过滤器，过滤消化液，放入超净台中备用。 6. 本实验方案仅供技术交流之用，实验方案提供者不承担以此实验方案发生的一切事故责 任。
注意：心肌细胞头 2-3 天会抱团，一个集落一个集落地跳，3 天后会慢慢铺开，表现为细
胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第 4-5 天时可以看到成片跳动，如果种的密度低， 就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。一般心肌细胞种在塑料基底的培 养皿或培养瓶中，合适的细胞密度下心肌细胞可以从第 2-3 天开始跳动，大约持续到第 4-7 天的，或许更长的时间，而在玻璃基底上（明胶包被）种的细胞有时也能坚持到 7 天，一般 都坚持不了。细胞不聚成一片，细胞纯度可能不够，成纤维细胞等较多，细胞难以连接；心 肌细胞密度较低；细胞的生长状态不好，受到支原体或环境条件的抑制；培养基和血清是否 合适（我们常用 Gibco 10% FBS+Hyclone DMEM），或者这两者存在一些问题，这都是有可 能的。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
心肌细胞
心肌细胞培养实验方法[基本原理]心肌细胞培养用机械方法及酶消化法，将心肌细胞分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件下使之生长繁殖，并保留其结果与功能特性。
[设备及试剂]1 仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱(可用恒温培养箱代替)、离心机、电磁搅拌器、恒温水浴、PH值测定仪、普通及倒置显微镜等,以及一般实验室设备.2 常用试剂有以下几种：培养基：常用Eagle、199、1640、F10、F12、PuckN-16B SM20等。
其中国产的Eagle培养基（MEM)较为常用，根据实验的特殊要求，可选用无糖、缺氧，不同浓度的各种无机离子等特殊培养基。
平衡盐溶液：常用磷酸缓冲盐溶液（P、B、S），无钙镁磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）及Hank’S液等。
消化液：常用胰蛋白酶（Difco 1:250)，必要时加用胶原酶，弹性蛋白酶等。
抗菌素溶液：取青霉素100万单位，链霉素1g，用双蒸馏水或磷酸缓冲液100ml，配成双抗液备用。
[操作步骤]1 心肌组织的选择：选择乳鼠的心脏。
2 心肌组织块的制备：乳鼠用75％乙醇或1％新洁尔灭消毒皮肤，固定四肢，胸部向上，再用2％碘酊及75％乙醇分别消毒胸腹部皮肤，用虹膜剪剪开胸部皮肤，暴露皮下组织，再用碘酊及乙醇消毒皮下组织，更换剪子及镊子，开胸取心，在盛有磷酸缓冲液或Hanks 液的瓶皿中洗涤后，剪去心房，将心室放入另一平皿中，用吸管吸取磷酸缓冲液反复冲液三次，洗净残留积血。
将一定数量的心室放入三角瓶或离心管的侧壁上，用虹膜剪剪成1mm3碎块，以备消化。
3 心肌细胞悬液的制备：根据实验要求，可选用一次或分次消化法制备细胞悬液。
后者较为常用，在大离心管中放入组织碎块及0.06~0.25% 的胰蛋白酶溶液8~15ml，加入磁棒两根，在磁力搅拌器上，37℃水浴中消化10分钟，自然沉淀，弃去上清，再加入胰蛋白酶液8~15ml，消化10分钟，再用吸管吹打组织块1分钟，自然沉降后，将上清液及沉淀物分别处理。
心肌细胞培养概况
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心肌细胞培养
原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。
然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。
细胞计
2
条件下培养。
于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。
细胞培养72h后用于实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏的主要细胞类型，其功能是维持心脏的收缩和舒张运动。
由于心肌细胞自身的特殊性质，其在病理学和药理学研究中具有重要的作用。
因此，对大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养具有重要的研究价值。
1. 材料与方法将健康的雄性SD大鼠用5%碘酒消毒，取出心脏并用PBS清洗，然后将其切成5mm×5mm的小块。
接着，将心肌块用0.25%胰酶和0.1%胆酸溶液（pH 7.4）在37℃水浴中消化30 min，然后加入完整培养基中停止消化。
用100μm的过滤网过滤后放在离心管中，500g离心5 min，取出混悬液上清液（含心肌细胞）。
将上清液平行于低浓度FBS培养基缓慢滴加到细胞培养瓶中，放置于37℃恒温培养箱中培养。
将细胞瓶中的细胞制备成单层细胞，加入适量的鼠抗α肌动蛋白单克隆抗体进行免疫染色。
观察细胞的形态和免疫染色结果，确定大鼠心肌细胞的纯度。
同时，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting等方法来检测心肌特异性基因和蛋白的表达水平。
1.3 第1代大鼠心肌细胞的培养将细胞瓶中的心肌细胞培养至80%的密度后，用0.25%胰酶溶液（pH 7.4）将细胞处理成单细胞，然后加入适量的完整培养基中，调整至适当的离心管中，进行离心操作。
沉淀细胞，再用适量的完整培养基悬浮细胞，取适量的细胞悬浮液加入到新的细胞培养瓶中，以此种方式连续传代，获得第1代大鼠心肌细胞的纯培养状态。
2. 结果通过以上方法，从大鼠心脏中成功分离出心肌细胞，得到了悬浮液。
悬浮液中的心肌细胞大小大约为10-15μm，可用影像学方法进行精细观察，获得细胞数量约为3×10^6个/ml。
通过α肌动蛋白的免疫染色和心肌特异性基因和蛋白的表达水平的检测，我们成功地鉴定出了大鼠心肌细胞的纯度，并且进一步证明了其心肌细胞的特异性。
通过培养，我们成功地获得了第1代大鼠心肌细胞的纯态，细胞生长状况良好，细胞数量增加较为显著。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
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新生大鼠心肌细胞培养技巧
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中
我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：
1新生大鼠鼠龄的选择新
生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长大量观测表明，选择1~3d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳
2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用
.
消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶
透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏
.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶
I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1g・L1,我们使用的为0.8gL1.胶原酶最好现用现配.
3消化程度的把握
新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感
.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测
.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意
:(1)转速一般控制在60~80rmin1左右
.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织
.(4)适宜温度为35~37℃
.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.
4接种的细胞密度
心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率接种细胞的绝对数量应经精确计算
.
一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.
5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.
因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染
6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞
.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长
.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％上的心肌细胞
.
7 换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48h后换液
.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实
此外，去血清后可用ITS和0.1gL1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响
.
8抗污染措施
除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：
(1)获取心脏时避免剪破消化道
比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会 .(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染
.(3)对于培养心肌细胞的观察、
照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率
9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：
(1)pH值会在过滤后上升0.1~0.3.
(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关
.(3)应及时换液.
(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用
.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
后来解剖开后才想起来，本科时候解剖老师说新生儿脏器位置偏低，，后来就在大约第5－6肋骨处插入剪刀尖，横向剪开胸骨，大概开口8ｍｍ就可以挤出心脏了。
每取一个心脏大约1ｍｉｎ。
２，培养基的使用，虽然大多数人用的是DMEM高糖培养基，可是又有人用的是1640，同样也有效果（心肌细胞波动良好），同时实验室里也有师兄正使用1640，我就偷懒，就用1640，可是细胞就是不搏动，后来查了资料才知道，1640的钙离子浓度太低，而DMEM钙离子浓度1.8×1000（－3）。
这是比较适合的浓度。
后来我就自己买了DMEM培养基就可以了，细胞博动的很好看。
３，消化心肌组织是出现絮状物质，没有办法去除，吸出已经消化的细胞时由于絮状物质的干扰不能吸出。
我试着加大离心速率，期待能去除，可是
2000rpm*10min离心后，居然它还是悬浮着。
那次消化心肌非常失败，后来有一次在医院食堂吃饭，同桌的一位脑外博士，提到他消化脑组织，消化过渡的时候也会出现，这样的现象，后来经人指点说的细胞破了，DNA出来了。
哦，我才恍然大悟，原来如此。
以前一味得追求心肌细胞消化的彻底，就把心肌组织剪成肉沫状，……。
以后消化的时候就是不能太小了。
４，在园子里提到两种消化方法，一种是用恒温振荡器，一种用磁棒搅拌，原来以为胰酶的合适温度是37度，我用前者，可是消化结果，细胞数量很少，经过8次每次消化8分钟后，剩余的组织块还是很大。
没有办法了，用后者，在室温20度的情况下消化结果好多了。
５，当我把组织都消化了，什么都没有剩余了，我就把那些液体去离心
1000rpm*10min（园子里一般推荐用的），可是我发觉：离心下来的细胞非常少，冥思苦想。
后来有人提示说，离心标准单位是用g，大约是350g，我就按半径换算了，结果发现350ｇ应该是1500ｒｐｍ。
于是下一次消化时改用了1500ｒｐｍ，细胞就多了。
不死心，把上清去除继续4000ｒｐｍ离心，发觉还是有细胞剩余，不过这些细胞台盼蓝染色存活率比较低约40％以上这些与大家共同讨论，谢谢。
我也是个新手，希望大家能互相帮助。
大鼠心肌细胞分离大鼠心肌细胞比乳鼠心肌难养，用无血清培养基，呈杆状，横纹清楚，在培养基里细胞不搏动。
大鼠心肌细胞分离一般是采用二型胶原酶分离，浓度为1mg/ml（用无钙台氏液配制），同时酶液里加入牛磺酸，BSA。
一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠开胸后，迅速取出心脏，放入冰的台氏液中，找到主动脉后，挂上Langendorff 装置，衡流泵灌入无钙台氏液（37度），开始心脏会搏动几下，这样把心脏中的淤血挤出（此处也有人用有钙台氏液流，好让心脏充分搏动，把淤血挤出，不过我们摸索发现只要取心脏到挂上去的时间短，一般搏动几下就能把淤血清楚干净了）。
几分钟后，换酶液开始灌流心脏，一般开始时，心脏较软，待消化一段时间后变硬，继续消化后又变软，且心脏发白，这时候就可以停止消化，将心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，继续加入KB液，吹打，直到上清液不浑浊为止，一般吹打3－4次即可。
将各次上清合并，吹打过滤后，沉降20分钟左右，弃上清，加入无血清培养基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，牛磺酸，BSA，肉毒碱，HEPES），吹打，1000转/分离心半分钟，弃上清，再洗1－2次后，将沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分钟（纯化心肌细胞），然后计数，点板或培养。
此法中如果各步注意无菌操作，最后先用加倍双抗的培养基培养24h后，再换正常培养基，可适用于条件不是很好的试验室。
如果能在板或瓶内加入Laminin处理后，贴壁很好。
如果分离出来的心肌细胞，逐级复钙后培养，状态更好。
最佳状态此中方法能培养7天以上.。