成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是研究心脏发育、疾病以及药物筛选的重要方法。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离方法、鉴定和培养条件。
1. 心肌细胞的分离器械准备：a. 心脏灌注系统：可以使用经过消毒的大鼠心脏外来供血灌流系统，灌流液为糖酸盐缓冲液（pH=7.4），温度为37℃。
b. 心脏切片工具：可以使用经过消毒处理的手术刀片和镊子。
2. 大鼠心肌细胞的分离步骤：a. 合适年龄和体重的健康大鼠，进行全麻处理（如异氟醚麻醉），并用顺风消毒剂进行消毒处理。
b. 快速取出心脏，将心脏放入含有糖酸盐缓冲液的灌流系统中。
c. 快速连接灌流系统，将糖酸盐缓冲液从左心房注入，以去除血液和离心区域的细胞。
d. 用含有酶的灌流液灌入，如含有胰酶、胶原酶和镁离子的消化液，同时加入适量的钙离子。
e. 离心和留取心肌细胞上清液，心肌细胞沉淀在离心管的底部。
1. 大鼠心肌细胞的鉴定器材准备：a. 活体显微镜：用于观察和记录心肌细胞的形态特征。
b. 细胞培养物皿：用于观察和记录心肌细胞的生长情况。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定步骤：a. 取适量的心肌细胞上清液，将其转移到培养皿中。
b. 使用活体显微镜观察心肌细胞的形态特征，如是否有纤维形态、异型心肌细胞、连接融合而成的网络等特征。
c. 使用显微镜观察心肌细胞的生长情况，如是否有脱落、生长迅速、形成网络等特征。
1. 培养基溶液的配制：a. 培养基条件：可以使用生长因子和胎牛血清进行补充，以促进心肌细胞的生长速度和功能发育。
b. 培养基液配方：常见的培养基液配方主要包括DMEM/F12、MEM、RPMI1640等。
2. 大鼠心肌细胞的培养步骤：a. 取适量的培养基液，加入适量的生长因子和胎牛血清。
b. 将心肌细胞沉淀悬浮于培养基液中，设置悬浮液的浓度。
c. 将培养皿置于带盖的离心转盘中，充分培养细胞。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是一个复杂而关键的过程。
通过合理选择器械和条件，可以成功地获得纯度高、活力好的大鼠心肌细胞，为研究心脏相关疾病的机制和治疗提供可靠的细胞模型。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的研究对象，分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是进行相关研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养方法。
1. 大鼠心肌细胞的分离方法：a. 准备消化液：将含有0.1%胰酶和0.05%胰蛋白酶的耗氧培养液(如DMEM/F12)预先加热至37℃。
b. 杀死大鼠：快速杀死大鼠，并立即进行心肌细胞的分离。
c. 开胸取心：通过剖开胸腔，将心脏暴露，并迅速取出。
d. 剪开心脏：用剪刀切开心脏的心室部分，将其放入预先加热的消化液中。
e. 贴壁处理：将心室组织液搅拌均匀，并放置在37℃培养箱中酶解。
每隔10分钟，用吸球轻轻吸取上清液，反复操作3-4次。
2. 大鼠心肌细胞的鉴定方法：a. 形态学观察：用显微镜观察分离得到的心肌细胞的形态，心肌细胞呈长条状，具有明显的纵纹和横纹。
b. 钙离子荧光染色：使用荧光染料如Fluo-4 AM来标记细胞内的钙离子，并观察细胞内钙离子的动态变化。
c. 免疫荧光染色：使用心肌细胞特异性标记物如肌球蛋白进行免疫荧光染色，观察标记物的染色情况。
3. 大鼠心肌细胞的培养方法：a. 培养基准备：将DMEM/F12培养液加入10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液和1%胎牛血清补充物。
b. 细胞接种：将分离得到的心肌细胞加入培养基中，浓度为1 * 10^5 cells/ml，并将细胞悬浮液加入培养皿中。
c. 培养条件：将培养皿放入恒温培养箱中，温度设定为37℃，CO2浓度设定为5%。
d. 培养液更换：一般情况下，每2-3天更换一次培养基，同时可添加适量的生长因子和激素。
e. 心肌细胞传代：当心肌细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代。
传代方法与培养方法相似，注意细胞的保持适当的密度。
大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是大鼠心肌细胞研究的关键步骤。
通过合适的操作和条件，可以获得纯度较高的心肌细胞，并进行相关研究。
需要注意的是，心肌细胞的分离和培养过程需要在无菌条件下进行，以避免细菌和其他微生物的污染。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏组织的重要细胞之一，对于心脏疾病的研究和治疗具有重要意义。
在进行心脏细胞的研究和培养过程中，对大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是非常关键的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一关键技术。
一、大鼠心肌细胞的分离大鼠心肌细胞的分离是进行心肌细胞培养的第一步，其关键在于有效地分离心肌细胞，保证细胞的纯度和活力。
以下是常用的大鼠心肌细胞分离的方法：1. 心脏采集：首先需要从大鼠体内取出心脏组织，最好选择小鼠、大鼠等小型动物，以便于获取足够数量和较为纯净的心肌细胞。
2. 心室组织的分离：将心脏组织置于含有氧气的离心纯化液中，迅速剪下心脏，并去除心包膜、心尖等结缔组织，然后将心室组织切成小段。
3. 细胞的分离和纯化：将切成小段的心室组织放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%重组胰岛素的胰酶溶液中进行消化，去除结缔组织和细胞外基质，然后用离心分离出心肌细胞。
4. 心肌细胞的过筛和纯化：经过离心后，得到的上清液中含有大量的心肌细胞和其他细胞。
通过过筛的方法，可以进一步提取纯净的心肌细胞，并将其进行鉴定和培养。
1. 形态鉴定：观察分离得到的心肌细胞在显微镜下的形态特征，包括细胞形状、大小、结构等。
正常的心肌细胞应该呈长条形、有交叉条纹，并具有丰富的胞浆。
2. 免疫细胞化学鉴定：通过染色技术，使用与心肌细胞特异蛋白相关的抗体标记心肌细胞，如肌动蛋白、肌钙蛋白等，观察其在心肌细胞中的表达情况，以确定其纯度和特异性。
3. 功能鉴定：通过检测心肌细胞的功能特性，如心肌收缩力、电生理特性等，来判断心肌细胞的活性和健康程度。
可以通过贴壁法、钙离子荧光示踪等技术手段来进行功能鉴定。
通过以上的鉴定方法，可以全面地评估分离得到的心肌细胞的纯度和活性，为后续的心肌细胞培养和实验奠定基础。
在分离和鉴定得到的心肌细胞可以进行培养，为心脏疾病的研究和治疗提供重要的实验材料。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。
为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。
1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。
（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。
（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。
2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。
（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。
（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。
（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。
（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。
（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。
（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。
（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。
（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。
（3）每2-3天更换一次新的培养基。
以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。
成年SD大鼠心肌细胞的培养
成年SD大鼠心肌细胞的培养翟迎九;董雪红;周丽诺;胡仁明【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2005(026)008【摘要】目的: 建立稳定的成年SD大鼠心肌细胞分离和培养的方法.方法: 主动脉插管逆行灌流分离成年SD大鼠心肌细胞,进行体外培养,并观察其形态的变化.结果: 刚分离的心肌细胞呈长杆状,表面有明显横纹,非同步博动,在含血清的培养环境中,细胞形态很快发生变化,出现去分化表现,在无血清的培养环境中,细胞保持刚分离时的在体形状,2 wk后细胞均明显萎缩.结论: 主动脉插管逆行灌流的方法是较为理想的成年SD大鼠心肌细胞分离与培养方法.【总页数】3页(P705-707)【作者】翟迎九;董雪红;周丽诺;胡仁明【作者单位】复旦大学医学院附属华山医院内分泌科,内分泌糖尿病研究所,上海,200040;复旦大学医学院附属华山医院内分泌科,内分泌糖尿病研究所,上海,200040;复旦大学医学院附属华山医院内分泌科,内分泌糖尿病研究所,上海,200040;复旦大学医学院附属华山医院内分泌科,内分泌糖尿病研究所,上海,200040【正文语种】中文【中图分类】Q813.11【相关文献】1.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定 [J], 付微;刘飞;乔陆明;张绪东2.新生SD大鼠心肌细胞的原代培养 [J], 赵勇;刘晓伟;林治宇;马雷;徐振宇;吕少春;李梅秀;田国忠3.新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法的比较 [J], 王凤阁;孙思琪;韩月;孔钰琳;张绪东4.缺氧对成年SD大鼠心肌细胞钙瞬变的影响 [J], 肖剑锋;黄泽炳;王春燕;沈建新;石刚刚5.成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定 [J], 李超彦;肖剑锋;沈建新;王海燕;陈耀文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是生物医学研究中常见的实验步骤。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 准备工具和试剂- 离心管、培养皿、组织研磨器、离心机、反应管等；- 消化酶（如胰蛋白酶、胰酶、胶原酶）、细胞分离缓冲液（如Hank's液、DMEM/F12液）- 磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、PBS缓冲液等。
2. 动物安乐死和心脏取出- 通过适当的麻醉方法将大鼠处死；- 固定大鼠，将心脏迅速取出。
3. 大鼠心脏组织的处理- 将心脏放入含有预冷的磷酸盐缓冲液的离心管中；- 用螺旋式切割器将心脏切碎并加入含有消化酶的组织研磨器中；- 用搅拌器均匀搅拌、体外消化。
4. 细胞的分离和纯化- 将组织胶块转移到筛网上，用PBS缓冲液冲洗细胞；- 收集细胞上清液，离心沉淀；- 用细胞分离缓冲液重新悬浮沉淀细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 大鼠心肌细胞鉴定试剂- 法斯琪染色试剂；- cTnI、cTnT等心肌特异标志物抗体；- 免疫荧光显微镜。
2. 法斯琪染色鉴定- 采用法斯琪染色方案对心肌细胞进行染色；- 使用显微镜观察是否出现蓝色染色反应，标志细胞为心肌细胞。
3. 免疫荧光鉴定- 使用抗体与心肌特异标志物结合；- 使用免疫荧光显微镜观察细胞是否出现荧光信号。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 大鼠心肌细胞的培养基- 常用的培养基有DMEM/F12液、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）等。
2. 细胞培养条件- 培养基中添加适当的血清（如胎儿牛血清）和抗生素；- 培养箱中保持37℃、5% CO2含量。
3. 大鼠心肌细胞培养步骤- 将分离得到的心肌细胞加入培养基中；- 在培养箱中培养细胞，定期更换培养基；- 进行细胞观察和实验。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种可供研究心脏疾病和相关生理学过程的重要模型细胞。
分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞对于心脏病研究具有重要意义。
本文将详细介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定方法以及培养步骤。
1. 动物准备根据实验需要选择2-3个月大的健康雄性大鼠。
提前饲养大鼠，使其适应实验环境，避免压力引起心肌细胞损伤。
实验前一天，禁食12小时但允许饮水。
2. 心肌细胞分离将大鼠按麻醉操作，使用90mg/kg的琥珀胆碱或90mg/kg的乙酯进行麻醉。
确认大鼠麻醉后，通过软组织剪刀取出心脏，将其置于冷却的Buffer A中。
(Buffer A: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES的PBS液)将心脏移至工作台上，用毛刷清洁心脏表面的血液和附着物。
然后将心脏转移至10cm 培养皿内，将血管外壁剪除。
将心房和心尖切掉，将心脏切割成小块，并转移到15 mL离心管中。
加入5 mL Buffer A，并使用移液器缓慢混合。
使用1000 rpm进行梯度离心 (5 min)。
根据实验需要，可以选择制备低密度（20%离心液缓冲液）或高密度（50%离心液缓冲液）梯度离心。
将上清液去除，将沉淀与Buffer A混合。
将混合液过滤，去除残留的大块异物。
可使用0.22 μm的滤膜将上清液过滤。
收集上清液至50 mL离心管中，离心10 min(1000 rpm)。
去除上清液，保留沉淀。
再次挤压沉淀，使其成为小碎片。
将沉淀与37°C的Buffer B液混合。
(Buffer B: 含有137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 0.44 mM KH2PO4, 4.19 mM NaHCO3, 5.5 mM glucose, 10 mM HEPES, 10 mM taurine, 10 mM BDM的PBS液)以500 rpm离心5 min，去掉上清液，保留沉淀。
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成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室许秀芳 李温斌* 陈宝田* 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。
结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4~6 1。
结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。
关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术中图分类号:Q253;R322.1+1自从1953年Durrows和M oscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。
对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。
成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。
国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。
1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。
1 材料和方法1.1 材料实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150~200g,由本研究所实验动物室提供。
DMEM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞号心脏停跳液由本院体外循环组提供。
实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DMEM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,pH7.2~7.4,过滤除菌。
酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。
1.2 方法采用离体心脏灌注法分离心肌细胞[2,3]。
Wistar大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(含1 200肝素45mg/kg),麻醉满意后胸腹部用75%乙醇消毒,!U∀字形切开腹壁,快速剪断左右前腔静脉及后腔静脉,经升主动脉根部灌注4#高钾安贞号心脏停跳液30m L,待心脏停跳呈灰白色后取下心脏,接在Langendorff 灌注架上,按下列步骤进行实验:1)清洗心脏:用无Ca2+、Mg2+的D H ank 液灌洗心脏5m in即可;目的是解离桥粒和细胞间连结。
由于Ca2+在心肌细胞连结上起重要作用,用无Ca2+的液体灌洗心脏能带走大量的Ca2+,心肌细胞间糖蛋白被破坏,桥粒和连结随之解离。
2)溶解细胞外基质:应用酶消化液37#灌注,保持灌注压在4.90~7.84kPa(50~80 cmH2O)。
3)心肌细胞的释放:经一定时间(30~90 min)酶消化后,心肌细胞外基质大部分被消化,但细胞间连结如缝隙连结并没有完全断开,心脏仍保持大体形态,松弛状,机械作用才能将细胞分开。
见心脏变软、呈暗红色,取下心脏,轻揉搅拌几分钟后剪下心室肌,剪成1mm3大2000年 6月第21卷 第2期首都医科大学学报Journal of Capital U niversity of M edical SciencesJun.2000V ol.21 N o.2收稿日期:1999 03 09*首都医科大学附属北京安贞医院心外科小的组织碎块或呈匀浆状,用200目钢网过滤,D Hank 液冲洗,收集滤液。
4)心肌细胞的收集和Ca 2+耐受的建立:细细胞的密度高,加适量的D H ank 液后,低速离心(800g ,15min)可分离低纯度的心肌细胞,去上清后加入D H ank 液与Hank 液的混合液(1 1)适量,800g 离心,15min,去上清后加入Hank 液洗1次,以上过程称为!复钙∀。
5)心肌细胞的进一步纯化:离心分离的心肌细胞仍混有一些其他细胞,如内皮细胞、成纤维细胞,用梯度离心法,Ficoll 分离液分离,心肌细胞沉在最低层,将沉底的心肌细胞用2%牛血清白蛋白(BSA)悬起,800g 离心,20min,心肌细胞沉在低层,用DM EM 完全培养液配成2∃106mL -1。
6)心肌细胞的培养和形态学观察:心肌细胞50 L 加DMEM 250 L,加样于96孔培养板,共16孔,另取心肌细胞1mL 加DM EM 完全培养液2mL 于50mL 培养瓶中,两者均于37#5%CO 2条件下培养,每天换培养液1次。
细胞培养96h 后观察心肌细胞的形态并照相。
取出培养瓶中的细胞800g 离心后再用2%的BSA 液悬起,再离心后心肌细胞用5%戊二醛固定,尽快做透射电镜检查。
7)心肌细胞质量评价:于心肌细胞培养1d 后应用形态学及台盼蓝(trypan)染色法做心肌细胞质量评价。
方法为取8孔心肌细胞做台盼蓝染色,镜下观察心肌细胞形态并计数1000个心肌细胞,杆状未着色者为存活的心肌细胞,计算心肌细胞的存活率。
2 结果心肌细胞形态观察:培养1d 后经台盼蓝染色证实为存活的心肌细胞静止贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比为4~6 1。
培养3d 后心肌细胞内混杂的少量红细胞已经死亡,混杂的白细胞、成纤维细胞、内皮细胞等经3次换液后已极少,培养4d 后的心肌细胞做光镜及电镜检查,电镜照片示心肌肌丝清楚,肌节明显,线粒体清楚,无明显水肿,无空泡化(图1、2)。
培养1周后心肌细胞形态同前,未见明显分化。
培养板各孔心肌细胞的存活率结果见表1。
图1 成年Wistar 大鼠单个心肌细胞电镜片 在DM EM 完全培养基中培养4d,示心肌细胞肌节清楚,线粒体丰富,无明显水肿、空泡化 ∃15600图2 成年Wistar 大鼠单个心肌细胞电镜片 在DM EM 完全培养基中培养4d,示心肌细胞肌节清楚,线粒体丰富,无明显水肿、空泡化 ∃52000105第2期许秀芳等:成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察表1 心肌细胞存活率*孔号活细胞数/个存活率/%192392.3291291.2389189.1495195.1590290.2693293.2788988.9892692.6总计66791.7*每孔的细胞数均为1000个3 讨论本研究采用离体心脏灌注法,用Ficoll分离液梯度离心分离成年大鼠心肌细胞,用离体心脏灌注法即取出动物心脏,经升主动脉根部灌注生物酶以消化心肌细胞间质从而分离心肌细胞。
常用的生物酶有胰蛋白酶及胶原酶。
胰蛋白酶主要用于分解组织间质的蛋白成分,作用较强,同时对心肌细胞膜蛋白亦起较强的破坏作用,故对酶的质量浓度及作用时间要求严格,质量浓度多为1~20g/L,本研究为5 g/L,作用时间应取决于酶的活性及质量浓度,一般在10~60m in。
应根据心脏的形态、色泽判断心肌细胞分离的情况,并及时应用牛血清白蛋白来中和消化。
胶原酶作用较缓和,主要用于消化细胞间质中的胶原纤维以释放心肌细胞,它可和胰蛋白酶同时应用或分开使用,应用效果各家报道不同,尚无一致意见。
本研究同时应用胰蛋白酶及胶原酶分离心肌细胞,存活率达到91.7%,培养1周存活良好。
另外还可缩短心肌细胞的分离时间,减少心肌细胞缺血时间,便于心肌细胞的存活。
生物酶灌注法由于其分离心肌细胞的效果及质量较好,现已广泛应用,但必需具备一定的分离技术方可分离出大量的完好心肌细胞,对实验条件、技术要求较高。
由于要求取下完整的心脏,该方法难用于人心肌细胞的分离,是其一大缺点。
心肌组织浸泡法即应用生物酶浸泡已被剪成极小碎块(1mm3)的组织,应用生物酶渗入细胞间质以分离出心肌细胞,由于在酶渗透过程中,对心肌细胞间质作用时间的不均一性,对外表的心肌细胞破坏严重,故分离心肌细胞的效果较差,但该方法便于用于人心肌细胞的分离。
关于贴块法,主要用于新生动物心肌组织,将心肌组织剪成1mm3大小之碎块,置于培养液中,利用新生心肌细胞易生长的特性,依靠心肌细胞的分化生长出单个心肌细胞。
该方法用于成年动物效果差,很少使用。
心肌细胞的培养方法类似于一般细胞。
培养液多选用DM EM、Medium199、William液,并加入10%~20%的胎牛血清或小牛血清。
关于血清的用途及机制目前尚不十分清楚,可能为提供粘附底物和一些必需的营养物质如生长因子、激素等。
培养液的pH值为7.35~7.45,细胞生长过程中养分的消耗和代谢产物的聚积可导致培养液pH值稍有降低,可利用培养箱中CO2含量(5%)来缓冲培养液的pH值。
有关培养底物[4],人们发现对培养瓶壁进行适当处理可增快贴壁速度。
为提高培养成活率,可加入明胶、%型胶原和&型胶原、Laminin、胎牛血清(FCS),及在制作培养瓶时对玻璃或塑料作特殊处理等不同方法。
由于心肌细胞较一般细胞如内皮细胞体积大、密度高,故培养1h 左右存活的心肌细胞即可贴壁生长,而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死。
培养24h后即可分离出存活的心肌细胞。
由于心肌组织中含有18种细胞,故培养前的细胞纯化很重要,应尽力去除非心肌细胞,尤其是成纤维细胞、白细胞,以免污染心肌细胞,影响其作为一种实验工具。
成年心肌细胞的传代培养至今未能建立起稳定的方法[5],而幼年细胞的传代培养较易。
心肌细胞的质量评定:分离的心肌细胞的鉴定方法很多,有形态学、电生理学、心肌酶学、台盼蓝等,但以形态学和台盼蓝最为常见。
形态学方法质量评估标准为[6]:∋细胞完整,呈杆状,长宽比为4~6 1,肌纤维膜上无空泡;(自律性的细胞所占比例较低,因为心肌细胞的自律性说明心肌细胞有破坏,只有培养的正常心房肌细胞可有低频率(0.02Hz)的舒缩活动;)106首都医科大学学报第21卷在一段时间内(如30min)测定完整的心肌细胞减少率最低。
参 考 文 献1Poper H M ,G er rit I.Isolated adult cardiomyocytes.Raton:CRC Pr ess Inc N.W.Boca,1989.44~802K irby M S,Poole W ilson P A.Impo rtance of cal cium and liyaluronidase concentrations in t he preparation of isolated calcium tolerant myocytes from adult rat and rabbit hearts.J Physiol,1986,373:88~1043M itcheson J S,M ancox J C,Levi A J.Cultured adult cardiac myocytes:F utur e applications,cul tur e methods,mor pho logical and electrophysiolog ical properties.Cardiovasc Res,1998,39(2):280~3004Cheung J Y ,L eaf A,Bonventre.Determinatio n of i solated my ocyte viability.Staining metho ds and functional criteria.Basic R es Cardiol,1985,80(supp1l):23~365Piper H M ,Spahr R ,Pr obst I,et al.Substrates for the attachment of adult cardiac myocytes in culture.Basic Res Cardiol,1985,80(suppl 2):175~1926Lawr ene B,Bug ai sky,Radovan Z.Differentiatio n of adult rat car diac myocy tes in cell culture.Circu Res,1989,64(3):493~500Morphology Study and Isolated and Cultured Method of Adult MyocytesXu Xiufang,Li Wenbin *,Chen Baotian *,L Yanning,Zhao Limin,Chen YanBeij ing H eart L ung and Blood Vessel InstituteAbstract:In order to build m ethod of a stable isolation and culture of adult myocytes,adult rat my ocy tes were isolated with bioenzymes (including 5g/L trypsin and 1g/L colleag ase)perfusing tissue throug h acceding aorta of the heart.Calcium tolerant m yocytes w ere harvested,purifyed and cultured w ith DM EM culture medium.T he myocytes quality was evaluated w ith morphology and trypan blue dye.States of myocytes grow ing in culture w ere observed w ith optical microscope and electron m icro scope photography.Result:Survival rate of aduld rat myocytes w as 91.7%,survival myocytes w ere mo tionlessly attached to the bottom of culture plates,they were intact and rod shaped,their length/w idth ratio w as 4~6:1.Conclusion:The method of isolation and culture of adult rat myocytes was successful.Key words:adult rat myocy tes;trypsin;colleagase;separation technique*Depar tme nt of Heart S urgery of Beij ing A nz he n Hospital,Af filiate o f Cap ital Univer sity of M edical S c iences107第2期许秀芳等:成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察。