原代心肌细胞培养方法探讨
原代心肌细胞培养技巧【转】
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH 上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。
新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定
网络出版时间： 2013-9-25 18： 33
Culture and identification of cardiomyocytes in neonatal rats
HU Bao-kui，GENG Zhao-hua，ZHU Shan-jun，LIU Yu-feng （ Department of Cardiology，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037， China）
在消化过程中，注意控制适宜的温度，在 37℃ 酶的活性较高，能获得很好的消化效果。每次消化 时间应控制在 10 min 以内，以避免长时间消化酶对 细胞的损伤作用。避免产生气泡，因为气泡表面的 张力作用可牵拉损伤细胞。用吸管反复吹打，使细 胞脱落，可缩短消化时间。
心肌细胞和成纤维细胞在培养板中的贴壁速度 不同，成纤维细胞比心肌细胞更容易贴壁，采用差速 贴壁可纯化心肌细胞，适当延长贴壁时间可提高心 肌细胞分离的纯度。本实验将贴壁时间延长至 90 min，获 得 高 纯 度 的 心 肌 细 胞，同 有 关 报 道 相 一 致［4，5］。但此种 方 法 只 适 合 短 期 培 养，不 适 合 细 胞
2 结果 2． 1 心肌细胞的形态学观察 心肌细胞消化后呈 圆形，培养 24 h 后基本贴壁生长，可见少数细胞开 始搏动，节律不规则，搏动微弱，细胞呈梭形或多角 形，核多为 1 个或两个，核仁清楚。培养 48 h 后心 肌细胞搏动增强，立体感明显，折光性强。培养 3 d 后，细胞伸出伪足交织成网，形成放射状排列的细胞 簇（ 图 1 ） ，呈 同 步 性 收 缩，搏 动 细 胞 百 分 率 约 为 80% ～ 90% 。
2. 2） % 。结论： 以本实验的方法培养的心肌细胞存活率高、纯度高，是一种较为理想的原代心肌细胞培养方法。
改良的原代心肌细胞培养方法
中 国 组 织 工 程 研 究 与 临床 康 复
舅 ， ， 卷 第 ６期 ２ ０ ０ ７ －０ ２—１ １出版
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｃｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒｅ ｈ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅＥ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇＲｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｆ ｅ ｂ ｒ ｕ ａ ｒ ｙ１ １ ， ２ ０ ０ ７ Ｖ ｏ Ｉ ． １ １ ， ＮＯ ． ６
基 础 医 学
改良的原代心肌细胞培养方法
王 强’ ， 王东进 ’ ， 李庆国 ’ ， 朱 凌 云 （ ’ 南京大学医学院 属鼓楼医院心胸外科 ， 江苏省南京市 ２ １ ０ ０ ０ ８ ； 南京大学生命科学院 ， 江苏省南京市
２ １ ０ ０ ９ ３）
Ａｎ ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｄ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｃ ａ ｒ ｄ ｉ ａ ｃ ｍｙ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ
高效 的心肌 细胞 培养 是组 织 工程 心 血 管相 关研 究
Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｎａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ０ ８ ， Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ｐｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓｃ ｉ ｅ ｎ ｅ， ｃ Ｎａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｓｉ ｒ ｔ ｙ ， Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｅ， ｃ Ｎａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ９ ３ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ）
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法
心肌细胞或肝细胞原代培养的方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!心肌细胞或肝细胞原代培养的方法在细胞培养中，心肌细胞和肝细胞的原代培养是研究这些细胞生物学特性的重要手段。
大鼠原代心肌细胞培养实验的
相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
心肌细胞分离与培养的教学内容与方法探讨
学内容 ， 提 高了教学质量和教学水平 。
△通讯作者 Ｅ － ｍ ａ ｉ ｌ ： ｗ ａ ｎ ｇ ． ｓ ｈ ｉ ． ｊ ｉ ｅ ＠ｓ ｔ ｕ ． ｘ ｊ ｔ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ
一
起 观察现象 ， 分 析原因 ， 寻找对策 。Ｂ组 学生的实验报告撰 写按 普通学 生实验 报告格 式进行 。（ ３ ） 评价： ①学生 评价 ， 口头
或 书面 ， 既指 出其优 点 ， 也指 出其不 足 ； ②教 师评价 ， 经 过综合 开放性 实验教 学培训 的学 生“ 科 研兴趣 提高 ” ， “ 积 极主 动性增 强” ， “ 动手能力更强”， “实验报 告撰 写内容更加丰 富、 规范” 等。（ ４ ） 困难 ： ① 缺乏 足够充分 的思想认识 ； ②适 当的管理模 式 ；
科研经验丰富 的教师 （ 主要是病理生理学专业 ） 组成 。（ ２ ） 实施 ： 将 １ ５ ０名本 科生先 按性别分 组 ， 再 根据随机 的原则将 男女学
生分别分配到 Ａ、 Ｂ两个实验组 ， Ａ组为综合开放性 实验 组（ ７ ５人 ） ， Ｂ组为验证性实验组 。Ａ组 学生在教师的指导下正确设计 实验 ， 并通过查 阅有关 文献 、 参考 资料 、 手册 、 工具书及其它信息源 获得 信息以解决实际问题 ， 当实验中遇到难题 ， 老师和他们
・
１ ９ｌ ７・
针 对 医 学本 科 生 的 综 合 开 放 性 实 验 教 学 实 践
汪 洋， 应 磊， 郝 卯林 ， 王 万铁
（ 温州医科大学病理生理学教研 室 ， 浙江 温州 ３ ２ ５ ０ ３ ５ ）
新生大鼠心肌细胞原代培养方法
（ ． ０ ９ Ｍ ｓ ｒ ｄ ｇｅ ａ ｄｄ ｔ ｏ Ｔａ ｊ ｎｖ ｒ ｔ ｏ Ｔ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉｅｅＭｅ ｉ ｎ ，ｉｎｉ ３ ０ ９ ： ． １ ２ ０ ａ ｔ — ｅｒｅＣ ｎ ｉａ ｆ ｉ ｉ Ｕ ｉｅｓ ｙ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌ ｈ ｓ ｄ ｉｅ Ｔ ａ ｊ ０ １ ３ ２ ｅ ｅ ｎｎ ｉ ｉ ｎ ｃ ｎ
原 代 心 肌 细 胞 培 养 技 术 被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾病 的研 究 之 中 ， 有 操 作 简 便 、 济 、 重 复 性 等 具 经 可
拘 。由天 津市 山川 红 实 验 动 物科 技 有 限 公 司 提供 ， 动物合 格证 号 ：０ ４ ３ 。 ０ ０ ０ ６
优点 ， 同时排 除 了神 经 、 液 等 因素 的干 扰 ， 可 从 体 并
Ｔａ ｉ ｉｅｓｔ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌＣ ｉｅｅ Ｍｅ ｉｉｅ Ｔ ａ ｉ ０ １ ３） ｉｎｉ Ｕｎｖ ｒｉ ｏ ａ ｉｏ ａ ｈｎ ｓ ｄｃｎ ， ｉｎｉ ３ ０ ９ ｎ ｙ Ｔ ｉ ｎ
【 ｓ ａｔ ０ｂｅｔ ｅ ｏｅｐｏｅｔｅｍ ｔｏｓ ｆｈ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ ａ ｉ ｙ ｓｆ ｅｓｃ ｉｇ Ａｂｔ ｃ】 ｒ ｊｃｉ Ｔ ｘｌｒ ｈ ｅ ｄ ｅｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｔ ０ ｔ ｕ ｋ ｖ ｈ ｏｔ ｉ ｕ ｃ ｄ ｃ ｅ ｒｈ ｎ
二、 实验 方法
１ 实 验动 物 ： ｄ内的 Ｗｉ ａ 新 生 大 鼠 ， 雄 不 ． ３ ｓｒ ｔ 雌
基 金 项 目 ： 家 自然 基 金 资助 项 目（ ｏ ８０ ２ ６ ） 国 Ｎ ． １７ ９ ５
作者单位 ：． １ 天津 中医药大学 ２０ ０ ９级硕士研究 生 ， 天津 ３０ ９ ； ． ０ １３ ２ 天 津 中医药大学 ， 天津 ３ ０ ９ ０ １３ 通讯作者 ： 张滕 ， ｍａ ：ａ．ｈｎｔｎ １３ ６ ．ｏ］ Ｅ ｉ ａａ ｚａｇ ｇ２ ＠１ ３ ｃｎ ｌ ｅ
2021简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法范文3
2021简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法范文 引言 原代心肌细胞培养是一项重要的体外实验技术，其为建造心血管疾病发生发展过程的模型及探讨基因、蛋白质及信号通路的变化提供重要的基础保障。
此外，在体内心肌细胞的活动受到神经、体液等多方因素的影响，限制对其病理变化的过程的研究。
而体外培养的原代心肌细胞不仅具有心肌细胞固有的活性，而且还有不受神经、体液等因素的影响的可控制性。
因此，原代心肌细胞培养的好坏，是影响实验的结果的关键因素之一。
本研究通过比较不同消化时间对原代心肌细胞的影响，探讨一套简便易行、成活率高的原代心肌细胞培养方法。
1材料与方法 1.1 实验动物选择出生 1 ~ 2 d 的 Wistar 大鼠，清洁级，雌雄不限，由内蒙古大学动物研究中心提供，合格证编号： csxk（蒙） 2002-0001.杨木小刨花垫窝，湿度 45% ~50%,温度控制在 21 ~27 ℃。
1.2 主要试剂及仪器 DMEM 高糖培养基（含 100U 青霉素 + 链霉素双抗）、胎牛血清、Ⅱ型胶原酶（ Worthington 公司，美国）、磷酸盐缓冲液（ PBS）、台盼蓝染色液； 5-溴-2-脱氧尿苷（ Brdu）、4% 多聚甲醛、过氧化酶阻断溶液、羊血清、α-actin抗体（兔抗大鼠）、二氨基联苯胺（ 3,3'-diaminobenzidine,DAB）显色试剂盒、SABC（链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法）免疫组化试剂盒、Mayor's 苏木精、二甲苯、TritonX. 100（生工生物工程有限公司，中国）、37 ℃恒温浴锅、医用超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、恒温离心机等。
1.3 实验步骤①将大鼠浸没在 75% 乙醇中消毒2 次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左侧剪开，压住肺叶，心脏收缩时可见其膨出。
眼科镊钝性分离下心脏，放入有10 mL 10% DMEM培养基（含双抗）的培养皿中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
原代心肌细胞培养方法探讨1邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014）周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021）摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。
采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。
结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。
表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。
关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠Explore a method of neonatal rat myocardial cells in cultureZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, ChinaAbstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity.Key words Myocardial Cells; Culture; Rat随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。
1材料与方法1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。
每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）蛋白酶液加入含有0.1mmol/L Brdu培养液5～10ml在标记处反复吹打，计数板计数细胞5×105/ml，根据需要传至培养瓶（板）中培养，多数3～4天后长成致密单层可用于实验。
1.2 培养心肌细胞的鉴定1.2.1 心肌细胞形态观察常规倒置显微镜观察细胞形态变化、心肌细胞搏动情况，并随时用Leica DMIRB Microsystems记录（Leica, 德国）；取培养心肌细胞单层飞片行苏木素－伊红染色（HE染色）后，光学显微镜下观察并照片。
培养细胞用0.1％胰蛋白酶消化后，离心，沉淀固定，送电镜室制片，透射电镜观察并摄片。
1.2.2 细胞成活率的测定取细胞悬液，并作适当稀释106/ml，按9:1加入0.4％台盼篮溶液混匀，显微镜下用计数器计数活细胞和死细胞。
1.2.3 鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（HHF35）的检测采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连接法（Streptavidin peroxidase conjunction method, 简称S-P法）。
具体步骤如下：单层细胞飞片清洗后95％酒精固定30min；PBS洗5min×3，滴加3％H2O2室温孵育10min；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，正常山羊血清工作液封闭，室温孵育10min；滴加适当比例的一抗工作液，37℃孵育4℃过夜；PBS冲洗，5min×3，滴加生物素标记二抗工作液，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20min；PBS冲洗，5min×3，滴加新鲜配制的DAB显色液显色5～10min；苏木素复染5～7min，1%稀盐酸分化1min，自来水返蓝；酒精剃度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并摄片。
2 结果2.1 心肌细胞形态倒置显微镜下可见传代细胞未贴壁呈圆形，贴壁后生长逐渐呈梭形、多角形，胞核1～2个、呈圆形、具有1～2清晰的核仁，细胞大小均匀，生长迅速，单个细胞自行蠕动，当生长成片后可见呈岛屿状搏动，搏动频率130～150次/分。
培养心肌细胞HE染色细胞形态饱满、细胞膜完整；透射电镜观察细胞完整，胞膜皱褶整齐，细胞中肌丝、线粒体清晰、分布均匀，细胞核完整。
（图1～3）2.2 心肌细胞成活率测定计数500个细胞，27个染色阳性，成活率94.6％。
2.3 肌动蛋白免疫细胞化学反应镜下观察肌动蛋白HHF35经S-P法培养的心肌细胞胞浆呈现深浅不一的棕褐色阳性表达，任选5张飞片，分别计数100个细胞，阳性细胞达96.4％（图4）；而用PBS代替一抗其结果均为阴性。
3 讨论构成心脏的细胞中约有80％为心肌细胞外，还有主要为成纤维细胞等非心肌细胞，本实验所取组织块尽量细小外，并一定要冲洗干净，放入培养瓶内时培养液不要过多易于贴壁，翻转瓶时间不要过长避免干涸，采用此种方法主要是便于心肌细胞迅速贴壁生长，培养液中加入Brdu抑制成纤维细胞DNA合成达到抑制增生的目的[1]；传代时先吹去组织块，然后依据心肌细胞的特性，快消化、轻消化，可看到细胞形态小的心肌细胞变圆，而细胞形态大的成纤维细胞仍伸展，立即中止消化迅速传代，仍用含有Brdu的培养液培养，3～4天后细胞形成致密单层即可进行实验。
此种方法培养的细胞可能与含有少量成纤维细胞促进心肌细胞贴壁和生长，有研究报道[2]成纤维细胞条件培养液有提高心肌细胞贴壁率及搏动率的作用，表明有促进心肌细胞搏动和生长的因子，也提示成纤维细胞与心肌细胞间可能存在着某种信号联系。
我们也观察到培养的心肌细胞成片搏动长达20多天。
心肌细胞搏动表明具有自律性的心肌细胞活性和状态良好；心肌细胞HE染色观察形态和贴壁情况；透射电镜观察可观察心肌细胞的超微结构肌丝和线粒体活性等[3]；对台盼蓝摄取反映细胞膜损伤和细胞死亡；肌动蛋白HHF35免疫细胞化学反映在细胞浆中阳性表达，可间接反映心肌细胞纯度。
通过反复实验我们体会到：①要选择24h内的新生鼠，而以12h内培养效果最佳。
②严格无菌操作，打开胸腔后迅速摘取跳动的心脏，操作要熟练快捷。
③细胞贴壁生长成致密单层后尽早进行实验，否则会降低心肌细胞的纯度，不利于对单纯心肌细胞的研究。
④传代消化时胰蛋白酶浓度不要过高，时间不要过长，最好在显微镜下观察，以免较牢贴壁的非心肌细胞浮起。
⑤选用飞片要薄，要紧贴培养瓶（板）不要留有气泡，可滴加少许培养液后再放置飞片。
⑥要注意培养液的稳定性，适量的血清浓度，适宜的pH。
只有这样才能培养出生长迅速、纯度高、活性好的心肌细胞。
4 参考文献1. Karliner JS, Honbo N, Epstein CJ, et al. Neonatal mouse cardiac myocytes exhibit cardioprotection induced by hypoxic and pharmacologic preconditioning and by transgenic overexpression of human Cu/Zn superoxide dismutase. J Mol Cell Cardiol, 2000 Oct; 32(10):1779-86.2.Suzuki T, Tsuruda A, Katoh S, et al. Purification of endothelin from a conditioned medium of cardiac fibroblastic cells using beating rate assay of myocytes cultured in a serum-free medium. J Mol Cell Cardiol. 1997 Aug; 29(8):2087-93.3. Rohr S, Scholly DM, Kleber AG. Patterned growth of neonatal rat heart cells in culture: morphological and electrophysiological characterization. Circ Res, 1991, 68:114-130.图1 第二代3d心肌细胞（×10）图2 心肌细胞HE染色（×40）图3 心肌细胞透射电镜（×20000）图4 心肌细胞Actin-HHF35（×20）。