病毒的增值培养 (2)
第二章 病毒的培养
五、细胞培养 （一）细胞培养的条件要求 1、细胞密度 原代细胞：4~6×105个/ml 传代细胞：2~3×105个/ml 2、pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3、培养温度
（二）细胞培养的方法 1、单层细胞培养 2、悬浮细胞培养 3、微载体细胞培养
（三）原代细胞培养 基本步骤：
1、血清（serum） 1）血清的种类和来源
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum)
７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml） 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总
数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K
（稀释倍数）。
○表示可计数 ●表示不计数
血细胞计数板
体外细胞的染色检测方法： 原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两 种细胞。 常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）
2、长途运送细胞培养物的保存。 取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养
液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留 空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的 包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右， 到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。
（六）细胞培养物的冻存与复苏 1、培养物的冻存与复苏原理
冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在 加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件）， 并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的温速率将冻存的培养物恢 复到常温的过程。
动物微生物-病毒的增殖和培养
详细描述
过滤分离法适用于从大量液体中提取病毒，通常使用孔 径大小适宜的滤膜，将病毒颗粒截留在滤膜上，而将其 他杂质通过滤膜过滤掉。该方法操作简便，但需要选择 合适的滤膜孔径以获得较高纯度的病毒。
蔗糖梯度离心法
总结词
利用不同浓度的蔗糖溶液形成的密度梯度，将病毒从混合物中分离出来的方法。
详细描述
蔗糖梯度离心法是一种常用的病毒纯化技术，通过在离心管中形成连续的蔗糖浓度梯度，将不同密度的病毒颗粒 分离。病毒颗粒在离心后会停留在相应的蔗糖密度层，从而达到纯化目的。该方法能够分离出较高纯度的病毒， 但操作较为繁琐，需要精确控制蔗糖浓度和离心参数。
复制周期
复制效率
不同病毒的复制效率有很大差异，有 些病毒可以在短时间内复制出大量的 子代病毒。
病毒的复制周期包括吸附、侵入、复 制、组装和释放等阶段。每个阶段都 需要一定的时间和能量来完成。
病毒的培养条件
01
02
03
培养基
病毒需要在适当的培养基 中才能生长和繁殖，如动 物细胞、昆虫细胞或细菌 等。
侵入
总结词
病毒进入宿主细胞内部的过程。
详细描述
在吸附完成后，病毒通过不同的方式进入细胞内部，如内吞、膜融合等。这一 过程需要病毒利用其自身的酶或诱导细胞内的信号转导途径来完成，以确保病 毒基因组能够进入细胞内部并开始复制。
脱壳
总结词
病毒基因组从其蛋白质外壳中释放出来的过程。
详细描述
在病毒进入细胞后，其蛋白质外壳会被细胞内的酶分解，使得病毒的核酸基因组得以释放。这一过程 对于病毒的复制是必须的，因为只有当基因组被释放出来后，才能利用宿主细胞的合成系统来复制病 毒的基因组和蛋白质。
详细描述
动物接种法是将病毒接种于易感动物，如小 白鼠、家兔、豚鼠等，观察其发病表现和病 理变化，以研究病毒的生物学特性和致病性。 这种方法可以模拟自然感染过程，但实验动 物感染病毒后可能出现死亡或发病，需要严 格控制实验条件和动物福利。
病毒—病毒的增殖(水产微生物课件)
任务二 病毒的增殖
2. 胞的内吞功能，如：牛痘病毒 ③病毒颗粒与宿主细胞膜上的受体相互作用，使其核衣壳穿入细胞浆中，如脊髓灰质炎病毒； ④完整病毒穿过细胞膜的方式如：呼肠孤病毒
任务二 病毒的增殖
2. 穿入
完整病毒 膜融合 内吞作用
任务二 病毒的增殖
3. 脱壳
病毒脱壳包括脱囊膜和脱衣壳两个过程： ① 脱囊膜：有的在与细胞膜融合时发生并向胞浆内释放核衣壳如疱疹病毒；有的在吞饮泡内发生如痘病毒。 ② 脱衣壳：发生在吞饮泡内或细胞浆、细胞核内，主要靠宿主细胞酶的作用。无囊膜病毒只有脱衣壳。个
别病毒的衣壳不完全脱去仍能进行复制，如呼肠孤病毒。
任务二 病毒的增殖
的特异性产物（病毒的抗原），宿主细胞膜加病毒抗原成分，这些部位就是核衣壳出芽的位置。
任务二 病毒的增殖
病毒的出芽释放
4. 生物合成
生物合成即病毒遗传信息的控制下合成病毒的各种组成成分及其所需的酶类。 早期：病毒特异性酶的合成 病毒核酸复制 病毒结构蛋白质合成 隐蔽期：病毒脱壳后，释放核酸，这时细胞内查不到病毒颗粒，成为隐蔽期。
任务二 病毒的增殖
5. 成熟与释放
成熟：由新合成的病毒成分装配成完整的病毒。 释放： 无囊膜的病毒：核酸与衣壳在胞核或胞浆内装配，细胞完全裂解时释放。 有囊膜的病毒：出芽释放。核衣壳在细胞内装配的同时，宿主细胞膜上会出现表达病毒基因编码
５．成熟与释放 ４．生物合成
任务二 病毒的增殖
1. 吸附
静电吸附：非特异吸附 与受体结合：病毒颗粒与细胞表面的受体结合，病毒与宿主细胞之间有选择性和有特殊亲和力
的特异性吸附。
任务二 病毒的增殖
吸附期 吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。
hpv疫苗制造工艺流程
HPV疫苗制造工艺流程
一、病毒培养与扩增
1.病毒接种
（1）将HPV病毒接种到合适的宿主细胞中（2）筛选合适的细胞系
2.病毒培养
（1）在细胞培养基中培养病毒
（2）控制培养条件和时间
二、病毒纯化与提取
1.细胞破碎
（1）采用机械或化学方法破碎细胞
（2）分离病毒颗粒
2.病毒纯化
（1）使用离心或过滤等技术纯化病毒
（2）去除杂质和细胞碎片
三、疫苗制备与配方
1.病毒灭活
（1）使用物理或化学方法灭活病毒
（2）确保灭活效果和安全性
2.疫苗配方
（1）加入适量的辅料如佐剂、防腐剂等（2）调配疫苗液体制剂
四、疫苗制剂灌装
1.灌装准备
（1）准备灌装设备和疫苗容器
（2）检查设备清洁和消毒
2.疫苗灌装
（1）将疫苗液体制剂灌装入疫苗容器（2）控制灌装量和速度
五、疫苗包装与贮存
1.包装
（1）使用合格的包装材料和标签
（2）包装成品疫苗
2.贮存
（1）将包装好的疫苗进行冷藏或冷冻贮存（2）控制贮存温度和湿度。
病毒增殖培养
病毒增殖培养(一)目的:1. 学习如何使病毒感染细胞。
2. 了解受病毒感染之细胞与正常细胞的不同。
3. 观察并认识细胞病变效应CPE。
4. 认识假性狂犬病病毒。
5. 学习摇摆振荡器的使用方法。
(1)组织培养:将人或动物的组织或打散的细胞以人工培养基培养，称为组织培养或细胞培养。
病毒可在活细胞中生长并且大量増殖，是培养病毒最常用的方法。
常用的有初代细胞(primary cell) 如胚肾、猴肾、胎盘羊膜、鸡胚细胞，细胞株(cell line) 如HeLa、Hep-2、KB及MDBK细胞。
大多数病毒增殖后，细胞可出现病变，变圆、空泡、溶解、脱落、坏死或融合，随病毒不同各异。
有些病毒可形成包涵体。
以上变化，普通显微镜就能看到。
(2)鸡胚培养:鸡胚是天然的活组织，不少病毒能在鸡胚的适宜部位生长繁殖，是分离培养病毒的有效方法。
常用的接种途径有尿囊腔（流感病毒、腮腺炎病毒）、羊膜腔（流感病毒的初次分离）、绒毛尿囊膜（天花、牛痘、单纯疱疹病毒）、卵黄囊（里奥病毒）。
病毒在鸡胚内繁殖后，有些可使鸡胚死亡，鸡胚和胚膜充出血，有的可使绒毛尿囊膜出现病毒斑(Avian Poxvirus)，有的可取尿囊液作血球凝集试验测定病毒的存在。
(3)动物接种:不少病毒可感染实验动物而增殖。
常用的动物有小白鼠、家兔、猴、鸡及猪等。
不同病毒选择动物种类与接种途径的选择，因病毒种类而不同。
神经性病毒可行脑内接种，呼吸道病毒可由鼻腔接种，此外还有腹腔、角膜、泄殖腔等接种途径。
接种后的动物需逐日观察，注意发病情况。
死亡后解剖检验病变。
《病毒的增殖》PPT课件
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噬菌体的一步生长曲线
（噬 菌 斑 数）
吸附期
潜伏期 （时
裂解期 间）
（一）、一步生长曲线（one step growth curve） 一、病毒的复制周期
噬菌体复制（繁殖） 的三个阶段：
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1、吸附期
游离的噬菌体吸附到宿主细胞
2、潜伏期
从噬菌体吸附到细胞到释放 出新噬菌体的最短时期
裂解量
噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可
达数百乃至上万个。
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一、病毒的复制周期
（二）、病毒侵染寄主细胞的过程
① 吸附adsorption/attachment ② 侵入penetration/injection ③ 脱壳uncoating ④ 病毒大分子的合成 病毒基因组的复制
3、裂解期
随着菌体不断破裂，新噬菌体 数目增加，直到最高值
（一）、一步生长曲线（one step growth curve）
取培养物直接测 定病毒数量
将培养物过滤去细 胞后测定病毒数量
将细胞裂解后测定病毒的数量 前期可将培养物先离心去上清以 消除未吸附病毒的影响
裂解量：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。 其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部 子代病毒数目，即等于稳定期病精毒品文效档价与潜伏期病毒效价之比。
与表达 ⑤ 装配 assembly ⑥ 成熟 maturation
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⑦ 释放release
（二）、病毒侵染寄主细胞的过程 1、吸附 adsorption/attachment
随机碰撞而接触（静电引力或氢键） 可逆吸附，无特异性（非细胞颗粒也可吸 特异性，不可逆吸附，启动病毒感染的第一阶段
病毒的细胞培养
细胞培养的基本概念
传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接 种到新的培养器皿中。
原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
二 主要优点
㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。
5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h 观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反 复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从 细胞中释放出来
正常形态的鸡 胚成纤维细胞
接毒后发生病变的 鸡胚成纤维细胞
（4）效价测定
某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利 用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。
细胞冻存方法
（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法 将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min ，弃上清。
（2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至 106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传 代及冻存日期。
（3）冷冻保存：将冻存管于4℃放置30min，然后 移入-80℃超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保 存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先 为每分钟下降速度1-2℃，当温度达到-25℃时，可 调整下降速度为每分钟5-10℃，温度降至-100℃时 ，再放入液氮罐中长期保存。
（4）细胞生长状况的观察
原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态
、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相 应的措施处理。
肉眼观察 显微镜观察
（5）细胞的冻存
传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。
三基考试-医技三基-基础理论-微生物与免疫学(第4部分)
4名词解释题1.VacA答案：( 即空泡毒素，是幽门螺杆菌分泌的一种蛋白毒素，可导致黏膜细胞发生空泡样变，是幽门螺杆菌主要致病物质之一。
)名词解释题2.Prion答案：( 朊粒(prion)是一种由正常宿主细胞自身基因编码的错构蛋白质，不含核酸，具有自我增殖能力和传染性，引起人和动物的传染性海绵状脑病(TSE) 。
)名词解释题3.亚单位疫苗(subunit vaccine)答案：( 是去除病原体中与激发保护性免疫无关或有害的成分，但保留能有效诱发机体产生免疫应答的细菌免疫原成分而制备的疫苗，称为亚单位疫苗。
)名词解释题4.地方流行性真菌答案：( 地方流行性真菌均属双相型真菌，引起的感染具有地方流行特点，包括荚膜组织胞质菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌及马尔尼菲青霉菌。
)名词解释题5.赫氏反应答案：( 部分钩端螺旋体病病人注射青霉素后出现寒战、高热、低血压，有的甚至出现抽搐、休克、呼吸和心跳暂停，称之赫氏反应，该反应可能与钩端螺旋体被青霉素杀灭后所释放的大量毒性物质有关。
)简答题6.什么是免疫球蛋白?什么是抗体?答案：( (1)免疫球蛋白：具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig) ，所以免疫球蛋白是一个结构化学的概念。
(2)抗体：抗体(Ab)是功能与生物学概念，它是在抗原刺激下由浆细胞产生的具有与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白。
虽然抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白都是抗体。
)简答题7.简述新生隐球菌所致疾病。
答案：( 新生隐球菌为机会致病菌，多数引起外源性感染，也可引起内源性感染。
该菌由呼吸道吸入，初始感染灶多为肺部。
肺部感染一般预后良好。
但该菌可从肺部播散至全身，引起皮肤、黏膜、淋巴结、骨、内脏等各部位感染，最易侵犯中枢神经系统，引起慢性脑膜炎。
)简答题8.什么是干扰素?有何作用?答案：( 干扰素是病毒或其他干扰素诱生剂刺激人或动物细胞所产生的一种糖蛋白，它具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。
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1、日常卫生 的重要性。
一、病毒增值的概述
病毒体在细胞外是处于静止状态，基本上与无生命的物质相似，当病
毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有
合成Байду номын сангаас身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，
必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒
的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式
病毒
病毒
病毒
病毒 病毒
细胞器
小 结
课后反思
我们学习完了病毒的概念、分类、形态和结构及病毒的增值方式。 1、我们学习病毒知识的目的是什么？ 2、我们学习病毒知识对防治疾病有什么意义？ 3、我们掌握了相关病毒知识后应该如何防治病毒性疾病？
作业
：
1、病毒增值的所有过程及特点。
《动物微生物》
我们前面学过 细菌生长繁殖 ？ 前导 课程
· 专业一年级 · 专业基础课
《病毒的增值》
动物微生物学是《畜 牧兽医学》基础课程，学 好本门课程是预防、治疗 控制疾病的前提。
教学目标
知识 目标 能力 目标 感情 目标
1、知道病毒是 怎么样侵入细胞 的。 2、知道病毒是 怎样繁殖后代的。
1 、病毒性疾病 的繁殖方式。
叫做“复制”。
2、看动画片总结病毒增值的过程
病毒
病毒
病毒
细胞核
病毒
细胞
病毒
细胞器
2、看动画片总结病毒增值的过程
生物合成： 病毒脱壳后，进入生物合成阶段，即病毒利用宿主细胞提供的环境和物质 装配与释放： 吸附： 吸附于宿主细胞表面是病毒感染的第一步。吸附主要是通过病毒体表面的配体 病毒核酸与蛋白质合成之后，在细胞浆内或细胞核内组装为成熟病毒颗 脱壳： 侵入：病毒脱去蛋白衣壳后，核酸才能发挥作用。多数病毒穿入细胞后，在细胞溶酶 1、膜融合病毒囊膜与宿主细胞膜融合，将核酸释放到细胞质中。 释放：成熟的病毒体以不同方式释放于细胞外。无包膜病毒均以破胞方式释放，即病 粒的过程是病毒的装配。不同种类的病毒在细胞内装配的部位也不同。 合成大量病毒核酸和结构蛋白。病毒核酸在细胞内复制的部位因核酸类型不同而不同。 2、吞饮作用：当病毒与受体结合后，在细胞膜的特殊区域与病毒一起内陷， 蛋白与易感细胞表面特异性受体相结合。不同细胞表面有不同受体，它决定了病毒的 体酶的作用下，脱去衣壳蛋白释放病毒核酸。痘病毒脱壳过程复杂，分为两步。先由 毒装配完成后，宿主细胞破裂而把病毒全部释放到周围环境中。有包膜的病毒，在装 除痘病毒外， DNA病毒都在细胞核内复制；除正粘病毒和逆转录病毒外， RNA病毒均 不同嗜组织性和感染宿主的范围，如小 RNA病毒衣壳蛋白特定序列能与人及灵长类动 整个病毒被吞入细胞。 溶酶体酶作用脱去外壳蛋白，再经病毒编码产生的脱壳酶脱去内层衣壳，方能使核酸 配完成后，以出芽方式释放到细胞外。 在细胞浆内复制。 完全释放出来。 物细胞表面脂蛋白受体结合。 3、直接进入：某些病毒直接通过细胞膜进入细胞质中。 细胞 细胞核