酵母菌细胞的固定化技术
04酵母细胞的固定
实验3 酵母细胞的固定化、温度对酵母菌呼吸速率的影响以及果酒发酵一、 实验原理采用包埋法固定酵母细胞，包埋法是指将微生物的细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中，使用海藻酸钠为载体（海藻酸钠：一种天然多糖，最早从褐色海藻中提取出来，它具有浓缩溶液，形成凝胶和成膜的能力）以此来操作有催化效率高，低耗能，低污染的优点。
使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，也可以被反复利用。
之后因为酵母菌会进行有氧及无氧呼吸，（有氧呼吸：C6H12O6+6H2O+6O2→6CO2+12H2O+能量（大量）无氧呼吸：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量（少量））通过排水法记录产生气体的速率，从而比较在不同温度下酵母菌的活性差异。
最后用固定化的酵母菌，利用微生物在有氧或五羊条件下的生命活动来制备微生物菌体及各种不同代谢产物的发酵过程来制作果酒（酒精发酵）。
二、 实验目的1.尝试制备固定化酵母细胞2.探究不同温度对酵母呼吸效率的影响3.练习设计简单实验装置4．使用固定化酵母细胞进行果酒发酵二、实验器材烧杯，玻璃棒，注射器，锥形瓶，水浴锅三、实验材料及试剂干酵母、CaCl 2、海藻酸钠、葡萄糖、苹果 四、实验步骤 （画出流程图）1.酵母细胞的活化：2.配制物质的量浓度为0.05mol/L 的 CaCl2溶液4.海藻酸钠溶液与酵母细胞混合5.固定化酵母细胞6.冲洗7.发酵五、实验结果记录、分析及讨论（照片及数据）1.形成的凝胶珠的颜色和形状：大部分凝胶珠呈透明或略黄灰状的球体，具有一定的可塑性和弹性。
在实验桌上轻轻挤压不会流出液体；在实验桌上摔打能比较容易弹起。
但也存在一些质量低的凝胶珠，这部分凝胶珠颜色较浅，一些有气泡夹杂其中；一些形状不为圆形或椭圆形，容易沉积到烧杯底部。
2.关于不同温度下酵母菌的发酵速率：可以发现温度越高，发酵反应的速率越快，即无氧呼吸速率越大。
但通过查阅资料可知，发酵速率与温度并非严格遵循正比例关系分布。
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化课题5 酵母细胞的固定化1. 游离酶、固定化酶和固定化细胞的⽐较(1) 物理吸附法(吸附法)是将酶吸附在载体表⾯的⼀种固定⽅法。
特点是⼯艺简便且条件温和，应⽤⼴泛。
实质是利⽤酶与载体之间的范德华⼒实现吸附。
(2) 化学结合法(交联法)是利⽤酶与载体之间形成的共价键将酶进⾏固定的。
2. 酵母细胞的固定化（1）活化:在缺⽔状态下，微⽣物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微⽣物重新恢复正常⽣活状态的过程。
（2）⽤蒸馏⽔配制CaCl溶液,⽽不⽤⾃来⽔。
原因是防⽌⾃来⽔中各种2离⼦影响实验结果。
溶液的作⽤：使胶体聚沉，凝胶珠形成稳定的结构。
（3）CaCl2（4）海藻酸钠的作⽤：包埋细胞。
溶液中浸泡⼀段时间，以便形成稳定的结（5）刚形成的凝胶珠应在CaCl2构。
（6）检验凝胶珠的质量是否合格，可以使⽤下列⽅法。
⼀是⽤镊⼦夹起⼀个凝胶珠放在实验桌上⽤⼿挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。
⼆是在实验桌上⽤⼒摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
（7）如果制作的凝胶珠颜⾊过浅、呈⽩⾊，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数⽬较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏⾼，制作失败，需要再作尝试。
3. ⽤固定化酵母细胞发酵（1）配制麦芽汁或葡萄糖溶液:注意浓度适宜，过⾼会造成固定的酵母细胞失⽔，甚⾄死亡。
（2）葡萄糖的作⽤：既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。
（3）固定化酵母凝胶珠的处理:固定好的凝胶珠从氯化钙溶液取出后要⽤蒸馏⽔冲洗2~3次。
洗去氯化钙溶液的⽬的是防⽌凝胶珠硬度过⼤，影响通透性。
（4）发酵:开始时凝胶珠沉在发酵液的底部，⼀段时间后慢慢上浮且有⽓泡产⽣，发酵液有酒味。
思考：1.发酵过程中锥形瓶为什么要密封？2.锥形瓶中的⽓泡和酒精是怎么形成的？3.发酵时为什么要将温度控制在25℃？例题：为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研⼈员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如下图所⽰。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
实验一 酵母细胞的固定化
实验一酵母细胞的固定化一、实验原理与目的原理：固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学方法将酶或者细胞固定在一定空间的技术，包括包埋法,化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法固定化，细胞多采用包埋法固定化。
常用的包埋载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维和聚丙烯酰胺等。
本实验选用海藻酸钠作为载体包埋酵母菌细胞。
目的:了解细胞固定化的原理；掌握酵母细胞固定化实验操作.二、仪器与用具仪器:50ml烧杯、200ml烧杯、玻璃棒、量筒、酒精灯、石棉网、针筒、三角瓶、水浴锅、恒温箱.化学材料：活化酵母菌(酵母悬液)、蒸馏水、无水CaCl2、海藻酸钠、葡萄糖。
三、试剂配制1、0.05mol/L的CaCl2溶液150ml；2、海藻酸钠溶液：每0.7g海藻酸钠加入10ml水加热溶液成糊状；3、10％葡萄糖溶液150ml。
四、实验方法与步骤1、干酵母活化：1g干酵母+10ml蒸馏水→50ml烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
2、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已经活化的酵母细胞,用玻璃棒充分搅拌混合均匀。
3、固定化酵母细胞：用20ml注射器吸取海藻酸钠与酵母细胞混合液，在恒定的高度（建议距液面12~15cm处，过低凝胶珠形状不规则，过高液体容易飞溅），缓慢将混合液滴加到CaCl2中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。
将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。
4、固定化酵母细胞发酵：用5ml移液器吸取蒸馏水冲洗固定好的凝胶珠2～3次，然后加入装有150ml10％葡萄糖溶液的三角瓶中，置于25℃发酵24h,观察结果。
实验开始时，凝胶球是沉在烧杯底部,24h后，凝胶球浮在溶液悬浮在上层,而且可以观察到凝胶球并不断产生气泡，说明固定化的酵母细胞正在利用溶液中的葡萄糖产生酒精和二氧化碳,结果凝胶球内包含的二氧化碳气泡使凝胶球悬浮于溶液上层.五、结果观察：打开瓶盖，闻气味,观察葡萄糖液中的变化。
实验酵母细胞的固定化-文档资料
了解固定化Байду номын сангаас胞的原理。 掌握用海藻酸钠制备固定化酵母细胞的方法。
二、 实验原理
工业上常用包埋法固定微生物细胞。根据包埋剂的特性 ，海藻酸钠在水相中加热溶解呈溶液状。将细胞加入混 匀，滴入氯化钙溶液中，由于离子的转移作用而凝固， 形成凝胶颗粒，凝胶颗粒中的微小空格将细胞固定。
海藻酸钙凝固的颗粒能反复使用，细胞在空格中可新陈 代谢（固定活细胞），也可以利用细胞中的酶进行酶促 反应（固定死细胞）。
本实验利用海藻酸钙凝胶包埋酵母生长细胞。
三、 实验材料和仪器
固定化细胞材料 2.5％海藻酸钠溶液20mL，加热助溶，冷至45℃备用。 配制50mL 1.5％CaCl2。 ● 20毫升注射器，150ml烧杯和50ml烧杯各一个、三角瓶、
35℃的酵母培养液，混合均匀。将混合液装入注射器中， 装上大好针头，以缓慢而稳定的速度将其滴入1.5％CaCl2 溶液中，边滴边摇动三角瓶，即可制得直径为3mm左右的 凝胶珠。
在CaCl2溶液中钙化30min，即可使用。
五、注意事项
加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环
一定要溶解彻底，在溶解过程中不断搅拌，在降温过程中不能低于45
℃，否则会凝固。
五、注意事项
海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量 如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠； 如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少
，影响实验效果。
五、注意事项
刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形 成稳定的结构
检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。 一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容
易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化!实验安全:1.使用酒精灯加热一定注意按照要求,防止烫伤、烧伤和引发火灾！2.实验材料一律不能入口，以防发生意外！一、实验目的1、简述固定化酶和固定化细胞的概念；2、说出固定化酶和固定化细胞的作用、原理、方法；3、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵；4、对实验结果进行评价和分析。
二、知识背景1.细胞固定化技术固定化酶和固定化细胞技术是利用物理或化学的方法将酶或细胞固定在一定的空间的技术（图1），包括包埋法、化学结合法（将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上）和物理吸附法（图2）。
一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。
这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
固定化酶优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用；固定化细胞优点：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化学反应。
本实验使用包埋法固定细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中，常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
本实验选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞：把酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入CaCl 2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
2.酵母菌酒精发酵在无氧条件下，酵母菌利用糖类发酵产生乙醇和CO2的作用，称为酒精发酵，总反应式为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2。
酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础。
本实验采用固定化酵母发酵，通过观察生成的CO2量以及最终产物酒精的量，可以判断固定化酵母的发酵能力。
三、材料器材材料及试剂：干酵母、水、海藻酸钠、CaCl2器材：烧杯2个（50ml，250ml）、天平、称量纸、玻璃棒、酒精灯、三脚架、石棉网、注射器、火柴。
四、方法与步骤（一）制备固定化酵母细胞1.干酵母活化称取1g活性酒精干酵母，加入10ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀成糊状，放置1h左右，使其活化（课前已准备）。
专题四课题酵母细胞的固定化
缺点
敏感，易失活； ②酶难回收，成本
不利于催化一系列 的酶促反应
高，影响产品质量
反应物不易与酶接 触，尤其是大分子 物质，可能导致反 应效率下降
实例
果胶酶
固定化葡萄糖异构 酶
固定化酵母细胞
[题组冲关]
1．下列说法不．正确的是
()
A．固定化酶和固定化细胞的方法包括包埋法、化学结合法
和物理吸附法
B．固定化酶更适合用化学结合法和物理吸附法制备
4．优点 (1)固定化酶既能与 反应物 接触，又能与 产物 分离， 还可以被 反复利用 。 (2)固定化细胞制备成本更低，操作 更容易 。
三、固定化酵母细胞的实验操作
1．活化就是让处于休眠 状态的微生物重新恢复正常的 生活状态。
2．配制海藻酸钠溶液时，要使用小火或者间断加热， 反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。
核心要点二 固定化酵母细胞的实验操作 1．实验操作流程
2．注意事项 (1)酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积 足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出。 (2)CaCl2 要称量准确，不能用自来水配制溶液；CaCl2 溶 液的作用是使海藻酸钠胶体发生聚沉，形成凝胶珠，因此需将 凝胶珠在 CaCl2 溶液中浸泡 30 min 左右，以便形成稳定的结构。 (3)海藻酸钠溶液的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海 藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的 凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
⑤固定化酵母细胞：用注射器以恒定的速度缓慢地将海藻酸钠和 酵母细胞混合液滴加到配制好的 CaCl2 溶液中，观察凝胶珠形成。 (1)请你改正其中两处错误的操作： 第一处________________________________________________； 第二处________________________________________________。 (2)刚形成的凝胶珠要在 CaCl2 溶液中浸泡 30min 左右，目的是 ________________________________________。 (3)如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明海藻酸钠浓度 _____________(填“过低”或“过高”)。
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化固定化酶和固定化细胞技术(1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
(2)常用的几种固定方式①包埋法，能将酶或者细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中。
②化学结合法，能将酶分子或者细胞相互结合或者结合到载体上。
③物理吸附法，能将酶或者细胞吸附在载体表面上。
一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。
（因为细胞个大，而酶分子很小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
）(3)常用的载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
(4)优点①固定化酶：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。
一定程度上避免了高温、强酸、强碱和有机溶剂等对酶活性的影响，从而提高催化效率，降低生产成本，提高产品质量。
②固定化细胞：与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。
（优势：操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收。
不足：大分子物质难以自由通过细胞膜。
）用固定化微生物细胞来生产酶，具有生产成本低，周期短，产量大等优点。
微生物产生的酶可以分为分泌在细胞外的胞外酶和包含在细胞内的胞内酶。
利用胞内酶时，需要将细胞破碎后，将酶分离纯化，但提取后酶的活性和稳定性往往都会受到很大的影响。
将微生物细胞限制或定位于特定空间位置，即将微生物制成固定化细胞后，既能避免复杂的细胞破碎、酶的提取和纯化过程，又能使酶的活性和稳定性得到较大提高，固定后的微生物细胞可以作为固体催化剂在多步酶促反应中发挥连续催化作用，同时，催化反应结束后又能被回收和重复利用。
实验操作1．制备固定化酵母细胞(1)固定方法：包埋法。
(2)载体：海藻酸钠。
(3)实验操作2．用固定化酵母细胞发酵(1)将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次。
(2)将150 mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200 mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25 ℃下发酵24 h。
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浓度太低：固定的酵母菌太少
第四步：将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
① 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵 母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中 ②注意事项 为什么要冷却至室温？
防止高温杀死酵母菌。恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，浸泡30min左右。 ②注意事项 为什么要浸泡30分钟？
③注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离 子影响实验结果
第三步：配制海藻酸钠溶液
① 过程 称取0.2g海藻酸钠，放入40ml蒸馏水，用酒精灯小火间 断加热至完全溶化。 ②注意事项 为什么要小火间断加热？
防止海藻酸钠焦糊。 为什么说该步骤是实验成败的关键步骤？
浓度太高：得不到规则的凝胶珠
酵母菌细胞的固定化技术
一、基本步骤：
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合 固定化酵母细胞
第一步：酵母细胞的活化
加水 活化
由于缺水，酵母处于 休眠状态
活化的干酵母
第二步：配制0.05mol/L的CaCl2
① 过程 称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml 的蒸馏水，使其充分溶解，待用 ② 目的 使胶体聚沉
以便凝胶珠形成稳定的结构
球形或椭 球形，浅 黄色
二、用固定化酵母发酵
1.将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用_蒸__馏__水__冲洗2~3次。
2.发酵时的温度就为__2_5_℃___，时间_2_4_h____（底物为葡 萄糖） 3.将凝胶珠加入用于发酵的葡萄糖溶液后会发现有_气__泡___ 产生，同时有_酒__精__味散发。