法医实验室几种常用DNA提取方法及比较
法医鉴定中的DNA分析技术

法医鉴定中的DNA分析技术DNA分析技术在法医鉴定中的应用DNA分析技术是一种非常重要的法医鉴定方法,它借助于DNA的特异性与稳定性,能够提供关于个体身份、亲子关系及犯罪现场等特定的信息。
本文将重点探讨DNA分析技术在法医鉴定中的应用,分别从DNA提取、DNA扩增、DNA测序以及DNA数据库的建设等方面展开讨论。
一、DNA提取DNA分析的前提是要从样本中提取出高质量的DNA,以确保后续分析的准确性。
在法医鉴定中,遗留物、尸体组织或体液等是常见的样本来源。
对于骨骼、牙齿等已经分解或陈旧的样本,需采用特殊的提取方法。
常用的DNA提取方法包括有机溶剂法、离心管法、硅胶柱法等。
这些方法能够有效地提取出DNA,并满足后续分析的需要。
二、DNA扩增DNA扩增技术是将样本中的微量DNA扩增至足够多的量,以满足后续的检测需求。
常用的DNA扩增技术包括聚合酶链式反应(PCR)和核酸序列依赖扩增(NASBA)等。
PCR是一种基于DNA聚合酶的体外DNA扩增技术,可以迅速扩增特定的DNA片段。
NASBA技术则可以实现RNA的扩增,对于需要分析RNA的情况有较好的应用价值。
三、DNA测序DNA测序是将扩增后的DNA片段进行测序,用于确定序列信息。
Sanger测序是常用的DNA测序方法,它利用不同长度的DNA片段在电泳中分离并排列,最终确定DNA序列。
此外,近年来,高通量测序技术的发展使得大规模的DNA测序成为可能,进一步提高了DNA分析的效率和准确性。
四、DNA数据库的建设DNA数据库的建设对于法医鉴定至关重要。
DNA数据库存储了大量的DNA样本信息,可以与现场物证和嫌疑人样本进行比对,快速确定身份。
现在许多国家和地区都建立了相应的DNA数据库,有效地提升了犯罪侦破和亲子关系鉴定的效率。
五、DNA分析技术在实际应用中的案例DNA分析技术在实际的法医鉴定中发挥了重要作用。
举个例子,某杀人案件中,犯罪现场留下了一根头发。
通过对头发进行DNA提取、扩增和测序,与嫌疑人DNA样本进行比对,最终确认嫌疑人为凶手。
提取dna的方法及原理

提取dna的方法及原理提取DNA的方法及原理DNA提取是生物学和遗传学研究中的一项基础操作,它是获取DNA样本的过程。
DNA提取的方法有很多种,下面将介绍几种常用的DNA提取方法及其原理。
1. 高盐法高盐法是一种简单且常用的DNA提取方法。
其原理是利用高盐溶液中DNA与其他细胞组分(如蛋白质)之间的亲和性差异。
在高盐环境下,DNA更容易溶解而不与蛋白质结合,从而实现DNA的提取。
具体步骤包括细胞破碎、加入高盐溶液、离心分离DNA和去除蛋白质等。
2. 酚/氯仿法酚/氯仿法是一种经典的DNA提取方法。
其原理是利用酚和氯仿两种溶剂的密度差异,将DNA从细胞中分离出来。
具体步骤包括细胞破碎、加入酚/氯仿混合液、离心分离DNA和去除蛋白质等。
3. 硅胶柱法硅胶柱法是一种高纯度DNA提取方法。
其原理是利用硅胶柱上的硅胶颗粒与DNA之间的亲和性差异。
DNA样本在经过一系列处理后,通过硅胶柱,DNA能够与硅胶颗粒结合,而杂质则被洗脱。
最后,通过洗脱DNA,即可获得高纯度的DNA。
硅胶柱法的优点是提取纯度高、操作简单,适用于分子生物学研究和临床诊断。
4. 磁珠法磁珠法是一种高效、快速的DNA提取方法。
其原理是利用带有亲和基团的磁珠与DNA之间的亲和性,实现DNA的选择性吸附和洗脱。
具体步骤包括磁珠悬浮液制备、样本加入、磁珠与DNA结合、磁珠分离、洗脱DNA等。
除了上述常用的DNA提取方法外,还有其他一些特殊的DNA提取方法,如酶解法、离心法、凝胶切割法等。
这些方法在不同的实验和应用中具有各自的特点和优势。
总结起来,DNA提取的方法多种多样,选择适合的方法取决于实验目的、样本类型和实验条件等。
无论采用哪种方法,都需要严格控制实验操作,以确保提取到高质量的DNA样本。
DNA提取的成功与否直接影响到后续的实验结果,因此在进行DNA提取时,需要注意样本的保存、细胞破碎的方式、溶解液的选择等因素,以获得可靠且高纯度的DNA。
DNA实验室常用的DNA提取方法有哪些

DNA实验室常用的DNA提取方法有哪些DNA提取是生物实验室中常用的基本实验操作之一,有许多不同的DNA提取方法可供选择。
以下是一些常见的DNA提取方法:1.高盐法高盐法是一种常见的DNA提取方法。
它利用高浓度的盐溶液中的离子和DNA分子之间的相互作用来分离DNA。
此方法使用高浓度的盐溶解细胞和脱水细胞核,然后使用酒精等溶剂沉淀DNA。
最后,通过洗涤步骤去除杂质,并用缓冲液溶解DNA。
2.酚氯仿法酚氯仿法是一种常用的DNA提取方法,广泛应用于基因组学和分子生物学研究中。
它利用酚氯仿混合物的不同密度分离DNA。
此方法通过酚氯仿混合物中DNA与其他细胞组分的相互作用,将DNA分离为有机相和水相。
然后使用酒精沉淀纯化DNA。
3.硅胶柱提取法硅胶柱提取法是一种常用的DNA纯化方法。
它使用硅胶柱过滤杂质,如RNA、蛋白质和其他污染物,然后将DNA吸附在硅胶柱上。
纯化后的DNA可通过洗脱步骤从硅胶柱中获得。
4.循环盐提取法循环盐提取法是一种经典的DNA提取方法,适用于从粉碎组织,血液和细胞中提取DNA。
该方法使用多种缓冲液、蛋白酶和溶液来处理样本,以去除RNA、蛋白质和其他杂质。
接下来,使用酒精沉淀提取出的DNA。
5.醇沉淀法醇沉淀法是一种快速的DNA提取方法。
它通过向样品中加入醇沉淀剂(如醋酸乙酯或异丙醇)来沉淀DNA。
醇沉淀发生时,DNA从溶液中析出。
然后,通过旋转离心将DNA沉淀并用缓冲液溶解。
6.热碱法热碱法是一种简单的DNA提取方法,通常用于从细菌和酵母细胞中提取DNA。
此方法使用高碱性溶液(如NaOH)溶解细胞膜和核膜,然后通过中和步骤得到纯化的DNA。
最后,通过酒精沉淀将DNA沉淀。
7.快速溶解法快速溶解法是一种快速提取DNA的方法,常用于大批量样本处理,如血液或组织样品。
该方法使用组织裂解缓冲液和蛋白酶,快速裂解细胞和细胞核,并用盐和异丙醇沉淀纯化DNA。
以上是一些常见的DNA提取方法,每种方法有其特点和适用范围。
DNA的提取方法

DNA的提取方法DNA提取是在分子生物学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
DNA提取的目的是获取足够纯净的DNA样本,以供后续实验和分析使用。
这篇文章将介绍几种常用的DNA提取方法。
1.高盐法:高盐法是最常用的DNA提取方法之一、它通过加入高盐浓度的缓冲液来破坏细胞膜并释放DNA。
首先,待提取的细胞或组织样本被收集并转移到离心管中。
接下来,加入裂解缓冲液,通常含有高浓度的盐并对抗离子泵,从而使细胞膜破裂并释放DNA。
裂解后,使用酒精或酚/氯仿萃取法来分离DNA与其他细胞组分。
最后,通过旋转沉淀法或乙醇沉淀法从溶液中提取DNA。
2.CTAB法:CTAB法是一种适用于植物和真菌等高纤维、低DNA含量的样品提取方法。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)作为一种阴离子表面活性剂,可以结合在DNA和脂质上,并形成沉淀,从而使DNA分离出来。
首先,样本被粉碎并浸泡在CTAB缓冲液中,含有CTAB、盐和EDTA等。
接下来,DNA与其他细胞组分一起沉淀,通过聚乙二醇进行沉淀,并通过离心分离。
然后,洗涤DNA沉淀并通过乙醇沉淀法或旋转沉淀法提取DNA。
3.柱式纯化法:柱式纯化法是一种用于高质量DNA提取和纯化的流程。
该方法基于DNA与硅胶膜吸附和洗脱的原理。
首先,细胞或组织样品经过裂解后,溶液经过去蛋白酶和去RNA酶处理。
然后,将样品通过柱子,DNA与硅胶膜相互作用,并形成强烈的结合,同时其他细胞组分被清除。
接着,使用洗涤缓冲液去除杂质,最后使用低盐缓冲液来释放DNA。
这种方法可以提供高纯度的DNA样本,适用于大规模DNA提取和高通量分子生物学实验。
4.磁珠法:磁珠法是一种基于磁性珠子的DNA提取方法。
该方法使用特定大小和表面修饰的磁性珠子将DNA选择性地吸附到表面上。
首先,待提取的细胞或组织样本被裂解,并加入磁珠和DNA结合缓冲液。
接下来,通过磁力将磁珠与DNA结合物分离出来,并洗涤去除杂质。
最后,通过低盐缓冲液将DNA释放出来并收集。
DNA提取方法和试剂作用详解

DNA提取方法和试剂作用详解DNA提取方法是生物学研究的一项重要技术,它能够从生物样本中提取出纯净的DNA,为后续的分子生物学研究提供基础。
目前常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、盐法、硅胶柱法和商业化试剂盒法等。
下面将对这些方法及其试剂的作用进行详细介绍。
1. 酚-氯仿法(Phenol-Chloroform Method)酚-氯仿法是最早被广泛采用的DNA提取方法之一、其基本过程包括细胞破碎、蛋白质沉淀和DNA沉淀。
酚-氯仿法的优点是能够提取较高质量的DNA,但操作过程较复杂且使用的试剂有毒。
2. 盐法(Salting-out Method)盐法是一种简单而高效的DNA提取方法,其基本原理是利用盐的溶液可使DNA凝聚并沉淀。
盐法操作简单,而且试剂价格低廉,适用于大规模DNA提取工作。
但其提取的DNA质量相对较低。
3. 硅胶柱法(Silica Column Method)硅胶柱法是一种基于DNA在硅胶膜表面吸附的原理进行的DNA提取方法。
硅胶柱能够高效地去除污染物,提取纯净的DNA。
硅胶柱法操作简单,适用于高质量DNA提取。
但硅胶柱试剂的价格较高,可能限制其在大规模DNA提取中的应用。
商业化试剂盒法是目前常用的DNA提取方法,其原理和操作流程已经被开发商精细化和商业化,使用方便,能够提取高质量的DNA。
商业化试剂盒法中的试剂通常包括细胞破碎缓冲液、蛋白酶、提取缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液等。
细胞破碎缓冲液用于破碎细胞膜,释放细胞内的DNA。
蛋白酶用于分解和去除蛋白质。
提取缓冲液中含有离子,可以使DNA溶解并与其他污染物分离。
洗涤缓冲液用于去除残留的污染物,洗脱缓冲液用于溶解并收集DNA。
商业化试剂盒法具有操作简单、提取效果稳定、重现性好等优点,逐渐取代了传统的DNA提取方法。
总结起来,DNA提取方法中常用的试剂包括酚、氯仿、盐、硅胶、蛋白酶等。
这些试剂分别用于破坏细胞膜、沉淀蛋白质、分离DNA并去除杂质,最终获得纯净的DNA样品。
法医鉴定DNA样本的采集与保存

法医鉴定DNA样本的采集与保存DNA样本的采集与保存在法医鉴定中扮演着至关重要的角色。
准确、可靠的DNA样本是确保案件公正审理以及识别身份的基础。
本文将探讨法医鉴定中DNA样本的采集与保存的重要性,以及常见的采集方法和保存措施。
一、DNA样本的采集方法DNA样本的采集过程需要专业、准确,以避免样本受到污染或损坏,从而导致鉴定结果的误差。
常见的DNA样本采集方法包括以下几种:1. 口腔拭子采集法:通过在口腔内腮帮子部位用特制的拭子进行刮拭,收集口腔内粘膜细胞,然后将拭子放入密封管中保存。
2. 血液样本采集法:通过抽取被鉴定者的一小部分血液,通常是静脉采血或指尖点血,用专用试剂盒保存血液样本。
3. 骨髓样本采集法:适用于无法从外部采集到合适DNA样本的情况,需要进行骨髓穿刺手术,从骨髓中提取DNA样本。
4. 毛发、指甲、唾液等非侵入性样本采集法:通过收集被鉴定者掉落的毛发、指甲、唾液等生物材料,然后将其放入密封袋中保存。
二、DNA样本的保存措施DNA样本在采集后需要得到妥善保存,以确保样本的完整性和可靠性。
以下是常见的DNA样本保存措施:1. 低温保存:DNA样本通常在-20℃或更低的温度下保存,以避免DNA降解或受到有害微生物的污染。
保存时应使用特制的低温保存盒或管,以防止样本受到外界温度变化的影响。
2. 化学保存:采用化学方法进行DNA保存可以保护样本不受降解的影响。
例如,可以使用乙醇或琼脂糖作为保存液,将DNA样本浸泡其中。
3. 防震、防护措施:在保存和运输过程中,应使用防震、防护的包装盒和容器,以防止样本受到振动、冲击或温度的影响。
4. 样本标识:为了避免样本混淆或交叉污染,每个DNA样本都应有明确的标识,如编号、日期、被鉴定者姓名等。
同时,应建立样本存储的登记表格,记录样本的详细信息。
三、DNA样本的保密性与合规性DNA样本的采集和保存涉及个人隐私和敏感信息,因此在进行法医鉴定时必须严格遵守相关法律法规。
法医学在法医学遗传学中的DNA提取与基因分型方法

法医学在法医学遗传学中的DNA提取与基因分型方法法医学遗传学是研究遗传规律和应用于法医学的一门学科,其中DNA提取与基因分型方法是其核心内容之一。
DNA提取和基因分型是法医学遗传学中常用的技术手段,它们在刑事侦查、亲子鉴定、人类遗传病的诊断以及鉴定和识别人类遗骸等方面发挥着重要作用。
一、DNA提取方法在法医学遗传学中,对于DNA提取有多种常用的方法,包括有机溶剂法、硅胶膜法和离心管法等。
这些方法都以提取样本中的DNA为目标,以高纯度、高质量的DNA为结果。
其中,有机溶剂法是最常用的方法之一,通过加入有机溶剂(如酚-氯仿、异丙醇等)来分离DNA。
而硅胶膜法则是利用硅胶膜的亲水性和亲脂性来吸附DNA,通过洗脱来获取纯净的DNA。
离心管法则是先用酶消化样本细胞,再用离心将DNA获得。
二、基因分型方法DNA分型是通过检测DNA序列或基因座等特定区域的基因型来进行的。
法医学遗传学中常用的基因分型方法主要有PCR扩增法、STR分型法和SNP分型法等。
其中,PCR扩增法是一种利用高温环境下DNA的复制进行扩增的技术,通过扩增特定基因片段,实现基因分型。
STR分型法则是通过扩增短串联重复序列来进行基因分型,这些序列在不同个体之间的重复次数不同,通过检测重复次数差异来鉴定个体身份。
SNP分型法则是检测单核苷酸多态性位点的基因型差异来进行基因分型。
三、法医学遗传学中的应用DNA提取和基因分型方法在法医学遗传学中有广泛的应用。
在刑事侦查中,通过提取犯罪现场的DNA样本,并与嫌疑人的样本进行基因分型比对,可以确定犯罪嫌疑人。
在亲子鉴定中,通过比对父母和子女的DNA,可以达到确认亲子关系的目的。
此外,DNA提取和基因分型技术也能够用于鉴定和识别人员的遗骸,通过与失踪者或受害者家属进行基因分型比对,从而作出身份鉴定。
四、方法的发展与前景随着科学技术的不断发展进步,法医学遗传学中的DNA提取和基因分型方法也得到了进一步的改进和提高。
大量提dna的方法(二)

大量提dna的方法(二)
大量提取DNA的方法
引言
DNA提取是分子生物学和遗传学研究的基础步骤之一。
随着科技
的发展,现在已经有多种方法可以大量提取DNA。
本文将详细介绍几种常用的DNA提取方法。
常见的DNA提取方法
1.酚/氯仿法
–使用酚和氯仿将DNA从细胞溶胶中分离出来。
–该方法适用于各种类型的样本,如细胞、组织和微生物。
–使用酚/氯仿法提取的DNA通常具有较高的纯度,适合后续的分子生物学实验。
2.碱裂解法
–通过加入碱性溶液,使DNA解除双链,从而将其提取出来。
–碱裂解法适用于微生物和某些植物样本。
–该方法操作简单,但提取的DNA纯度较低,可能需要额外的纯化步骤。
3.磁珠法
–使用表面带有亲和性的磁珠,将DNA与其他细胞成分分离。
–该方法通常结合特定的DNA结合试剂盒使用,可以自动化进行。
–磁珠法提取的DNA纯度较高,适合高通量实验,但设备和试剂成本较高。
4.玻璃纤维滤纸法
–利用玻璃纤维滤纸上的孔隙结构,将DNA分离并固定在滤纸上。
–该方法适用于小体积的样本,如血液和唾液。
–玻璃纤维滤纸法提取的DNA可以直接用于聚合酶链式反应(PCR)等实验。
结论
DNA提取是许多分子生物学和遗传学研究的基本步骤。
通过选择
适当的提取方法,可以获得高质量和高纯度的DNA样本。
以上介绍的
几种方法是常见的DNA提取方法,每种方法都有其适用的样本类型和
特点。
创作者应根据具体实验要求选择合适的提取方法,以确保实验
的成功进行。
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法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法原理:Chelex100是一种螯合树脂,由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成,含有成对的亚氨基二乙酸盐离子,起着螯合基团作用,对多价金属离子有极强亲和力。
在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下,可以使细胞膜裂解,并使与DNA结合的蛋白质变性,DNA游离。
检材基质中一般含有大量金属离子,在低离子强度及加热条件下,金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA,也可以抑制PCR反应,所以在提取DNA时,加入Chelex100,螯合了金属离子,防止了DNA降解,提高了PCR扩增成功率。
方法:剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材,置于0.5ml离心管内,加入适量纯水,室温浸泡,13,000rpm离心5min,上清丢弃,管底留约20μl左右液体及检材基质,加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等,100℃8min,13,000rpm离心5mim,上清备用。
评述:1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法,Chelex100法是万能的。
目前,我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行,Chelex100法又不是万能的。
2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要,因为现场检材往往均较脏,脏东西可以抑制PCR反应,所以往往不止清洗一次,清洗检材时可能损失部分DNA。
所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。
特别强调清洗时应“把根留住”,很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。
DNA检验时还有另外一句名言:“一个萝卜一个坑”,防止混乱检材。
肝素抑制PCR反应,血红素抑制PCR反应,所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。
在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下,多洗是检验成功所必须的。
血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的,而目前mtDNA 扩增一般用普通Taq酶,所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时,尽量去除干净血红素,显得尤为重要。
现场提取毛发或样本毛发,用毛根进行STR检验时,纯水清洗也非常重要,如果没有清洗干净,毛根DNA本身很少,很易检出为混合型。
因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。
毛根清洗的特点为振荡洗涤,不离心,多换水。
3、清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。
检材参考加入量0.5×0.5cm血斑150ul-200ul二步法精斑100ul毛根10ul烟头30-50ul4、对于组织,难溶检材,有疑问检材,均可加入终浓度为100ug/ml左右PK,有时间隔一段时间,补加适量PK,PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。
5、加入Chelex100后,56℃浸泡时间,血斑≥15min;组织≥30min,二步法精斑≥1h。
6、PCR扩增前应离心。
PCR扩增时不应吸入Chelex100,因为Chelex100为PCR抑制剂。
7、Chelex100使用浓度5%,有些人用10%,有些人用20%,各人爱好。
配制好5%Chelex100 pH应在10—11之间,否则应丢弃,不应人为调整Chelex100悬液pH值。
(二)有机法原理:有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合,采用不同方法提取DNA。
DNA易溶于水,不溶于有机溶剂,蛋白质分子表面带有亲水性基因,很容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液中,形成稳定的胶体溶液。
在有机溶剂存在的情况下,破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,使蛋白质变性沉淀,离心后,有机溶剂于试管底层(有机相),DNA继续稳定的存在于上层水相,蛋白质沉淀存在于两相之间。
水相中的DNA在大量冷无水乙醇及单价阳离子存在的情况下,水会溶于乙醇中,而DNA从水相中析出,沉淀,通过离心回收。
有机法中常用试剂为平衡酚、氯仿,酚及氯仿作用是使蛋白质变性,氯仿的另一作用是有助于水相与有机相分离,并抽提溶于水中(有时达12%)的酚。
平衡酚、氯仿及乙醇,三者互溶。
方法:剪取适量检材,置于0.5ml离心管内,清洗方法同用Chelex100法提取DNA,加入适量纯水及终浓度为100μg/ml PK,37℃-56℃孵育15min至数10小时,有时间隔一段时间补加适量PK →13,000rpm 5min→吸上清于另一管→加入等体积平衡酚→振荡或颠倒彻底混匀→13,000rpm 5min→吸上清水相于另一管,加入等体积1:1混合平衡酚:氯仿→振荡或颠倒彻底混匀→13,000rpm 5min→吸上清水相于另一管→加入等体积氯仿→振荡或颠倒彻底混匀→13,000rpm 5min→吸上清水相于另一管→加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上→13,000rpm 5-10min→弃上清→室温凉干或100℃5min烤干→加入10-20μl纯水→室温溶解或100℃5min帮助溶解→离心上清备用评述:1、有机法是经典DNA提取方法,目前国内外仍大量采用,其提取DNA特点为双链,纯度高。
2、有机法缺点是应用有毒有机试剂,对人体有害,污染环境;多次换管,容易引起检材污染及编号混乱。
有机法提取DNA的另一个缺点是不能去除某些染料,血红素等,而这些恰好是PCR抑制剂。
(三)磁珠法原理:(异)硫氰酸胍(GuSCN)是强烈蛋白变性剂,不破坏蛋白质一级结构,能破坏细胞膜及核膜蛋白,并使核酸酶失活,释放DNA。
磁珠可以特异性吸附DNA,与DNA结构及片段大小无关。
通过洗涤液洗涤,在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液,65℃解离后,DNA释放于洗脱液中。
方法:5%Chelex100提取DNA上清液或者用裂解液直接提取骨骼、指甲、毛发DNA上清液等约移于0.5ml离心管内→加入结合液100ul,磁珠5ul →振荡混匀,室温5min→在磁架上吸弃上清→加入洗涤液I 300ul → 振荡混匀→在磁架上吸弃上清→加入洗涤液II 300ul→振荡混匀→在磁架上吸弃上清→加入洗涤液II 300ul→室温放置2 min干燥→加入30-50μl 洗脱液,振荡混匀→65℃10min→速于磁架上吸上清于另一新离心管内,备用。
评述:1、磁珠法优点是简便、快速,不使用有机溶剂,安全无毒。
且经过笔者验证,磁珠法灵敏度非常高,于一根放置月余的带毛囊的毛发中成功提取到DNA且后期的STR分型检测中成功检测到19个位点。
由此可见,磁珠法非常适用于微量及疑难检材的DNA提取。
2、磁珠法与离心柱法比较,前者简单、方便,转移离心管次数较少,不易污染,而后者则正好相反。
3、目前磁珠法已被广泛地用于法医DNA实验中,国内的品牌主要有洛阳惠尔纳米科技有限公司的法医样本DNA试剂盒,该品牌生产的磁珠稳定性、灵敏性均居于世界前列,与国外某些品牌相比提取和纯化效果也毫不逊色。
(四)盐析法1988年Miller等报导经典盐析法提取血液DNA,其方法为溶解红细胞后,离心沉渣用PK消化,用大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质,离心上清中DNA用无水乙醇沉淀,用TE溶解。
(五)NaOH法原理:强碱溶解、变性蛋白质,破坏细胞膜及核膜,变性核酸酶,释放DNA,NaOH不破坏DNA一级结构。
方法:1、试剂配制裂解buffer 0.2M NaOH中和buffer 0.04M Tris-HCL pH7.52、实验步骤5μl或1×1mm血斑→加入450μl纯水→室温或37℃15-30min→13,000rpm 5min→弃上清→沉淀中加入20μl 0.2M NaOH(全血室温5min血斑75℃5min)→加入180μl 0.04M Tris-HCL pH7.5→振荡混匀,离心上清备用评述:1、一般认为碱性法提取DNA的主要缺点是DNA保存于碱中不稳定,4℃放置24h后PCR扩增往往失败。
NaOH法提取DNA STR检测不稳定(4℃保存24h后PCR为阴性)的主要原因是NaOH 未完全破坏DNA酶及DNA与蛋白质重新结合。
2、碱性法提取DNA的局限性。
烟头、邮票、口腔擦拭物、精斑、血斑、指甲等均可用碱性法提取,但是毛根、软组织等不能用NaOH法提取。
(六)五种DNA提取方法的比较1、Chelex100法及碱性法的优点是DNA提取时间短,单管,检材不易污染,缺点是提取DNA 纯度不高。
碱性法与Chelex100法比较,前者成本更低,缺点是提取DNA保存时间短,室温不超过7天,4℃及冷冻保存84天后均无法成功检见Amel及STR位点。
因为碱性法及Chelex100法均方便简单,提取DNA时间短,尤其适宜于建立DNA罪犯数据库及已知样本DNA检验。
2、有机法及磁珠法优点是提取DNA浓、纯,尤其适宜于特殊生物检材,微量疑难生物检材DNA提取。
有机法缺点是提取过程复杂,耗时,多管,检材易污染,及有机试剂污染环境、伤害人体。
磁珠法提取简单快捷,安全无毒,且无需频繁移管,检材污染可能性小,尤其适用于微量检材。
而且可配合工作站进行全自动操作,大大提高了提取的效率。
3、盐析法的优点包括便宜,不用有机试剂。
缺点是不易提取微量检材。
(七) DNA提取几种常用试剂作用及浓度1、PK 破坏蛋白质一级结构,使蛋白质成碎片,贮存浓度一般为5mg/ml,使用终浓度一般为100μg/ml,有时提取骨骼DNA的PK终浓度达5.5mg/ml。
PK最佳pH值为8.0。
2、SDS 既是蛋白变性剂又是表面活性剂(去垢剂),有变性蛋白质及保护蛋白质的双重作用,所以可以理解PK与SDS混用而不会破坏PK的原因。
贮存液浓度10%,使用终浓度一般为1%。
Triton、Tween与SDS作用相似。
3、EDTA 能螯合金属离子,防止脱氧核糖核酸酶降解DNA。