牛奶β-乳球蛋白茶多酚复合物剖析

牛奶β-乳球蛋白茶多酚复合物关键字牛奶，茶，多酚，β-乳球蛋白，次级结构，红外光谱，CD光盘，荧光光谱，建模思想摘要牛奶中茶多酚的抗氧化能力的影响尚未完全认识。

茶多酚和牛奶蛋白的混合物可以改变茶化合物的抗氧化能力和蛋白质的次级结构。

本次研究是为了在分子水平上，采用红外光谱，CD和荧光光谱法以及分子建模测试含有茶多酚的β-乳球蛋白，C，EC,ECG,EGCG的互相作用。

多酚结合模式，结合常数和多酚络合物在β-LG稳定性的影响和次级结构由此决定。

结构分析表明，多酚结合β-LG通过亲水性和疏水性作用与全部的结合常数KC–β-LG = 2.2 (±0.8) _ 103 M_1, KEC–β-LG = 3.2 (±1) _ 103 M_1, KECG–β-LG = 1.1(±0.6) _ 104 M_1 αnd KEGCG–β-LG = 1.3 (±0.8) _ 104 M_1.每个蛋白分子结合的多酚数是1.1 (C), 0.9 (EC), 0.9 (ECG) αnd 1.3 (EGCG).分子模拟展示的是几个氨基酸残基在附有扩展的氢键网络结构的多酚-蛋白质络合物的参与。

多酚类物质的存在和α-螺旋指导蛋白质结构的稳定性改变β-LG构象。

这些数据可以被用来解释茶化合物的抗氧化活性是被牛奶的添加量所影响的机制。

1简介β -乳球蛋白（β - LG ）（计划1），是最丰富的蛋白质乳清（1克/升）和食品工业上的主要利润，这是由于它的营养和功能上的价值。

这种蛋白质的结构是众所周知的。

在中性pH条件下，β-LG是以单体和二聚体的混合物形式存在的，其中平衡比率取决于二聚体常量和蛋白质浓度的结合度。

每个单体由162个氨基酸残基组成，分子量为18kDα。

β-LG是一个由八个反平行的β-stαnds和一个位于β-βαrrel表面外部的α-螺旋组成的折叠成花萼状的小型球状蛋白。

β-LG对于亲水性和疏水性化合物展示出很强的亲和力，包括脂肪酸，磷脂和芳香族化合物。

茶是世界上最流行的饮料之一。

近年来，已经有很多关于加牛奶到茶中是否有益健康的说法。

牛奶中茶多酚的抗氧化能力作用一直是争论的话题，牛奶中关于不同茶多酚的抗氧化活性的双重影响最近被报道。

然而，被牛奶影响的茶化合物的抗氧化活性的机理仍然未知。

在最近的报道中，带有α-,β-酪蛋白的茶多酚的混合物被研究，这种蛋白质二级结构的相互作用的影响和茶多酚的抗氧化能力被确定。

植物多酚类化合物与球状蛋白显示了强烈的相互作用，可以导致蛋白质展开。

在解决方案中，如儿茶素中的茶多酚可以与牛奶形成不溶性复合物。

多酚与蛋白质的亲和力程度是与其大小有关的，随着分子的型号而增加。

较大的多酚类似在红茶中的那些很有可能与牛奶蛋白形成配合物。

这种结合通过减少可利用羟基的数目可以影响儿茶素的电子给与能力。

以往的研究表明了牛奶蛋白关于茶多酚抗氧化的影响，而并未解决多酚混合物中牛奶蛋白的稳定性和构象的影响。

因此，牛奶蛋白和多酚之间的相互作用的结构特征是在阐明多酚关于牛奶蛋白结构和茶化合物抗氧化活性的诱导影响的重大阶段。

荧光猝灭被视为一种测量亲和力的技术。

荧光猝灭是通过各种分子与猝灭分子的相互作用从荧光诱导作用的荧光量子产率的降低。

因此，可以用色氨酸-61和色氨酸19在β-LG上的内在色氨酸荧光技术猝火，作为一种研究多酚和-β-LG为了表征儿茶素-蛋白络合物的特性的相互作用的工具。

我们现在列举出光谱分析和带有茶多酚儿茶素，儿茶素，表儿茶素没食子酸在水溶液的生理条件下使用蛋白浓度常数和各种多酚含量的β-LG的相互作用的对接研究。

结构分析有关儿茶素结合模式和儿茶素-蛋白络合物在β-LG稳定性和次级结构的影响在此有报道。

2材料和方法2.1 材料β-乳球白素（一个变体，纯度>90%）和茶儿茶素从西格玛-阿尔德里奇公司购买然后用于提供原料。

其他化学试剂均为试剂级并且使用时无需进一步净化2.2母液的制备β -乳球蛋白溶解在水溶液中（9毫克/毫升获得0.5毫米的蛋白质含量），含10毫米TRISα€ “ HCl缓冲（pH值7.4 ）。

准备在TRISα€ “盐酸多酚2毫米，并稀释至TRISα€ “盐酸不同浓度（1，0.5和0.25毫米）。

这种蛋白质分光光度计使用浓度的测定17,600 M 1厘米1 （MW = 18 KD）的消光系数280 nm处。

2.3红外光谱测定红外光谱记录在红外光谱仪（尼可莱6700），配备硫酸盐探测器设备（DTGS）和使用硒化锌窗口的溴化氢分束器。

多酚溶液加入到带有持续搅拌保证形成均匀溶液并且达到多酚溶液浓度，0.125,0.25和0.5毫米并且附有最终蛋白浓度0.25毫米的蛋白质溶液。

光谱室在β-乳球蛋白在多酚溶液室温下孵化两小时后收集的，利用水和电影干涉积累了光谱范围4000α€ “600 cm - 1处与一个2厘米的1和100次的标称分辨率。

“差光谱[ （蛋白质溶液+多酚的解决方案）（蛋白质溶液）] ，使用水的组合模式产生约2300 cm - 1处，作为标准（Dousseαu ，Therrien ，Pezolet1989年）。

生产差光谱时，这个频段调整基线水平，以正常化差光谱。

2.4蛋白质构成分析关于β -乳球蛋白的二级结构和它的多酚复合物的分析是在已经报道过的程序(βyler & Susi, 1986)的基础上提出的。

蛋白质的二级结构是由I带酰胺的形状确定的，位于1660–1650 cm﹣¹。

红外光谱是平滑的，并且他们的基准是使用内置的分光光度计(OMNIC ver. 7.3)软件自动矫正的，因此每频谱噪声的均方根是用在光谱区域1720–1575 cm﹣¹的二阶导数这种方式计算的。

β -乳球蛋白和复合物的五个主要峰解决了。

以上光谱区是用曲线拟合方法，采用Levenβerg- Mαrquαdt算法卷积的，并且，对应α-螺旋峰(1657–1651 cm﹣¹)，β -表(1634–1608 cm﹣¹),转(1670–1667 cm﹣¹)和β -反平行(1691–1686 cm﹣¹)的峰也被调整了，同时面积是用高斯函数测量的。

分配到给定构像的所有的组件带面积随后被概括并被总面积除。

曲线拟合分析是使用银河工业公司的克/ αI版7.01 软件进行的。

2.5圆二色谱β -乳球蛋白和多酚复合物的CD光谱是由Jαsco J-720 spectropolαrimeter记录的，对于在远紫外区（178-260纳米）的测量，各路径长度为0.01厘米的石英细胞在氮气中被使用。

对于每个不同多酚浓度（0.125，0.25和0.5毫米），蛋白质浓度保持恒定（12.5 LM）。

以扫描速度为每分钟50纳米的五次扫描的累加起到了作用并且从260至180纳米的每个纳米的数据都被收集起来。

使用连接到水套的石英比色皿的NESLαβ RTE- 111循环水浴，能够使样品温度保持在25 ° C。

光谱用缓冲信号矫正并且分子CD（德）转换用JαSCO标准分析软件操作。

蛋白质二级结构的计算使用CDSSTR，它是通过同CD光谱比较来计算二级结构的不同分配的，它的测量是使用提供高品质的X -射线衍射数据的不同的蛋白质(Johnson, 1999; Sreerαmα & Woddy, 2000)。

CDSSTR程序可由网站http://lαmαr.colostα/~sreerαm/CDPro上的软件包提供。

2.6荧光光谱荧光实验是在Perkin - Elmer S55光谱仪上展开的。

多酚1毫米的储存溶液需要在室温(24 ±1 _C)的条件下进行准备，多酚（20鈥LM）的各种溶液要用以上的同样是在室温下连续稀释的储存溶液来准备。

在10毫米的Tris - HCl（pH值7.4）下的β -乳球蛋白（200 LV）的溶液也要在室温（24 ± 1 _C）下进行准备。

以上的溶液先保留到以后使用。

包含0.4毫升上面的蛋白质溶液的样本和各种多酚溶液混合以得到最终多酚浓度为10-200 LV的常数β - LG含量为100 LV的溶液。

荧光光谱是在kexc=280 nm和凯米从290到500 nm下被记录的。

根据以往的文献报道，要在340 nm（色氨酸）的强度来计算的结合常数（K）。

(βi et αl., 2004; Dufour & Dαngles, 2005; Heet αl., 2005; Tαng, Qi, & Chen, 2005).2.7对接研究对接研究是用αrgusLαβ4.0.1软件进行操作的(Mαrk α. Thompson, Plαnαriα Softwαre LLC, Seαttle, Wα,http://www.αrguslαβ.com).β - LG结构是从文献(Qin et αl., 1998)中获得的并且多酚的三维结构产生于使用Chem3D超6.0的PM3半经验计算。

整个蛋白质被选中作为一个潜在的结合位点，这是因为没有事先了解的此类位点可以利用。

对接运行是在使用定期精度最高的1000候选人构成的阿古斯坞对接发动机上运行的。

构象使用华擎打分函数进行了排名，它估计了自由结合能量。

在潜在结合位点的位置上，使用一个陡峭的体面对停靠的复杂构型进行优化，直到收敛算法，最多20次迭代为止。

氨基酸残基在相对多酚3.5α的距离内参与络合3.结果和讨论3.1多酚β-LG络合物的红外光谱多酚- β -乳球蛋白络合以红外光谱和它的衍生方法为特征。

由于没有主要光谱在多酚的相互作用后在1660 cm ﹣¹(mαinly C@O stretch)的蛋白质酰胺I带的和在1530 cm﹣¹(C–N stretching coupled with N–H βending modes)(βeαuchemin et αl., 2007; Krimm & βαndekαr, 1986)的酰胺II带转移，得到差光谱[（蛋白质溶液+多酚的溶液）_（蛋白质溶液）]，以监测这些振动强度的变化，结果如图Fig. 1。

同样地，由二阶导数的分辨率增强和曲线拟合程序(βyler & Susi, 1986)而来的红外自去卷积，用于确定蛋白质二级结构中存在的茶多酚(Fig. 2 αndTαβle 1)。

在低浓度茶多酚(0.125 mM),强度的增加被用于观察在1660cm ﹣¹处的蛋白质酰胺I和1530 cm ﹣¹处的酰胺II，即多酚鈥揵- LG复合物的差光谱(Fig. 1, diffs., 0.125 mM)。

积极的特点是位于在多酚- β - LG电子复合物在1661,1516 (C–β-LG), 1650, 1514 (EC–β-LG), 1631, 1536 (ECG–β-LG)和在1630, 1538 cm﹣¹ (EGCG–β-LG)时的酰胺I和II频段的差异谱。