中性红染色液(液泡系专用)
实验三 线粒体和液泡系的超活染色与观察
实验五线粒体和液泡系的超活染色与观察实验目的一、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布。
二、学习一些细胞器的超活染色技术。
实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞舶死亡。
活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学，，特性起重要作用。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。
一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。
詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。
实验用品一、器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀、载玻片、凹面载玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
二、试剂1．Ringer溶液氯化钠0.85g(变温动物用0.65g)氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml2. 10％、1／3 000中性红溶液称取0.5g中性红溶于50 ml Ringer液，稍加热(30~40'C)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。
实验6 液泡系的超活染色与动态观察
实验6 实验 液泡系的超活染色与动态观察
【实验目的】 实验目的】
1 掌握超活染色压片技术。 掌握超活染色压片技术。 2 观察植物根尖各区细胞内液泡的形态、数量与分布变化。 观察植物根尖各区细胞内液泡的形态、数量与分布变化。
【实验原理】 实验原理】
中性红为弱碱性染料,对液泡系的染色有专一性 中性红为弱碱性染料 对液泡系的染色有专一性, 对液泡系的染色有专一性 只将活细胞中的液泡系染成红色,细胞核与细胞 只将活细胞中的液泡系染成红色 细胞核与细胞 质等完全不着色,这可能是与液泡中某些蛋白质 质等完全不着色 这可能是与液泡中某些蛋白质 有关。 有关。低浓度的中性红染液是对植物细胞液泡 进行超活染色的最为重要也是最为常用的碱性 染料。 染料。
【作业】 作业】 1 绘制小麦根尖示意图 示细胞中液泡的动态 绘制小麦根尖示意图,示细胞中液泡的动态 变化(每个区绘三个以上细胞 每个区绘三个以上细胞)。 变化 每个区绘三个以上细胞 。
2 简述从根尖的生长点到成熟区，根尖细 胞 简述从根尖的生长点到成熟区， 中的液泡发生了哪些变化？ 倍物镜下找到观察目标，观察整体形 首先在10倍物镜下找到观察目标 倍物镜下找到观察目标， 然后转到40倍物镜 先观察根尖的分生区细胞， 倍物镜， 状。然后转到 倍物镜，先观察根尖的分生区细胞， 可见细胞质中散布很多大小不等的染成玫瑰红色的 圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后， 圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，观察伸长 在这些分化伸长的细胞内，液泡的染色较浅， 区，在这些分化伸长的细胞内，液泡的染色较浅， 体积增大，数目变少。最后，观察成熟区细胞， 体积增大，数目变少。最后，观察成熟区细胞，在 这些细胞中，一般可看到一个淡红色的中央大液泡， 这些细胞中，一般可看到一个淡红色的中央大液泡， 占据细胞的绝大部分， 占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近 细胞壁处。注意在实验过程中观察液泡的形态、 细胞壁处。注意在实验过程中观察液泡的形态、数 体积及染色深浅的渐变。 目、体积及染色深浅的渐变。
实验室常用染色液配方
实验室常用染色液配方1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。
2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。
将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。
将两者混合即成。
3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。
将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。
两液混合即成。
4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾 2.0克蒸馏水300毫升先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。
5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。
7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。
8、刚果红染色液刚果红(Congo red)2.0克蒸馏水100毫升9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.010、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。
中性红染色液(活细胞专用)
仅供科研版本号：180102
中性红染色液(活细胞专用)
【产品组成】
【保存条件】
室温,12个月
【产品概述】
中性红是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4～8.0之间(由红变黄)。
分子式为C15H16N4·HCl，分子量为288.78。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌。
由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。
死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
中性红染色液(活细胞专用)呈中性，是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成红色的染色液，细胞核中的核酸以及溶酶体呈酸性，因此细胞核会被染成红色。
【使用方法】
1、样品处理：去除细胞培养液，用PBS清洗或生理盐水清洗1次。
2、中性红染色：弃PBS，加入适量的Neutral Red stain(活细胞专用)完全覆盖细胞，染色2～10min。
3、用PBS清洗或生理盐水清洗1次，立即观察或拍照。
【注意事项】
1、中性红染色液长期存放会产生少量沉淀，一般不影响使用。
2、首次使用本试剂时建议先取1~2个样品做预实验。
3、中性红染色液时，可以根据染色结果和要求调整时间。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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中性红染色液
中性红染色液(Neutral Red,0.1%)产品简介：中性红是一种弱碱性pH 指示剂，变色范围pH6.4～8.0之间(由红变黄)。
分子式：C15H16N4·HCl，分子量：288.78。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。
中性红染色液(Neutral Red stain)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成红色的染色液。
本染色液常用于组织或细胞染色中细胞核的红色复染。
产品组成：主要成分：主要由中性红、去离子水等组成。
自备材料：1、4%的多聚甲醛，亦可采购Leagene的多聚甲醛溶液(4% PFA)(DF0135)2、蒸馏水3、不同浓度的乙醇操作步骤（仅供参考）：1. 样品处理a) 对于石蜡切片：二甲苯中脱蜡5～10min。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10min。
无水乙醇5min。
90%乙醇2min。
70%乙醇2min。
蒸馏水2min。
b) 对于冰冻切片：蒸馏水2min。
c) 对于培养细胞：用4%多聚甲醛固定10min以上。
蒸馏水洗涤2min。
换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2min。
2. 中性红染色a) 对于上述处理好的样品，用Neutral Red stain (0.1%)染色2～5minb) 用蒸馏水或自来水充分洗涤。
c) 进行观察和拍照。
注意事项：1、如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。
如果样品是石蜡切片，需自备70%和90%乙醇，无水乙醇以及二甲苯。
2、首次使用本试剂时建议先取1~2个样品做预实验。
3、中性红染色液可以根据染色结果和要求调整时间。
死活细胞鉴定
生物探究活动——鉴定植物细胞的死活【实验目的】学习用质壁分离法和用活体染色法鉴定细胞死活【实验原理】活细胞的原生质层具有选择透过性；而死细胞则为全透性。
选择透过性是质壁分离的先决条件。
因此能发生质壁分离的细胞就表示是活的，不能发生质壁分离的细胞则说明是死的。
死活细胞间不仅通透性不同，而pH值等情况也不同，它们对某些染料的反应明显不同。
某些染料能在活细胞的细胞液中积累，但不能染活的原生质；另一方面，这些染料可使死细胞的结构染色，但不积累于液泡。
所以可根据某些染料活体染色的情况来鉴定细胞死活。
【实验材料和用具】洋葱及其它植物材料、酒精灯、显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、1M蔗糖溶液、0.01%中性红溶液等。
【实验步骤】1、用质壁分离的方法鉴定细胞的死活。
撕洋葱表皮细胞滴加1M蔗糖溶液，在显微镜下观察。
细胞很快发生质壁分离，这就是细胞活着的证据。
另把制取的同样制片，用冷冻、加热、干燥、酒精浸泡等方法将它们的细胞杀死，然后取代上述活材料，做质壁分离实验，结果看到已死的细胞不能发生质壁分离现象。
用尿素、硝酸钾、氯化钙溶液等来代替蔗糖溶液，能快速鉴定细胞的死活。
2、用活体染色的方法的鉴定细胞的死活。
取洋葱或其它材料，用镊子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用锋利的刀片轻轻刮去多余部分），或用刀片做成切片若干，将表皮或切片浸入中性红溶液中，放置5-10分钟最后用清水浸洗后置于载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察。
活细胞的液泡内染成红色至紫色，原生质不染色，死细胞常呈橙红色，原生质和细胞核被染色。
撕破的细胞，只剩细胞壁时，呈淡红色或淡紫色。
为进一步鉴别细胞的死活，可把玻片上的水溶液吸去，滴一滴1M蔗糖溶液，便可观察到活细胞能发生质壁分离，死细胞及只剩细胞壁的空细胞都有没有这种现象。
可用加热、冷冻或其它方法杀死植物组织，然后用上面所述方法进行处理，比较与活组织有何不同。
注：1台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
实验二、活体染色
活染注意问题
1、染料使用浓度： 中性红体外一般1/1000－1/3000，动物注 射可达1％－2％ 健纳绿：1/3000－1/5000 2、配染液用溶剂 尽量接近观察材料生活环境的液体
（二）植物叶肉细胞线粒体染色及观查
1、取清洁载玻片（最好放在37℃恒温箱）， 滴2滴0.02％詹纳绿生理盐水液； 2、撕取小片植物叶下表皮，放入染液中压实； 3、染色10－15min； 4、加盖玻片，吸水纸吸去周围多余染液 5、观察叶肉细胞中线粒体的形态、大小及分 布
肝组织詹纳绿染色及肝细胞线粒体观察
实验仪器用品
普通光学显微镜 小剪刀 圆头牙签 载玻片与盖玻片 胶头吸管
实验操作
（一）口腔粘膜上皮细胞詹纳绿染色 1、取清洁载玻片（最好放在37℃恒温箱），滴2滴 0.02％詹纳绿生理盐水液； 2、用牙签钝头在自己口腔脸颊粘膜处用力刮取上皮 细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液中搅匀； 3、染色10－15min； 4、加盖玻片，吸水纸吸去周围多余染液 5、观察口腔粘膜上皮细胞及其中染成蓝绿色的线粒 体，画图示线粒体形态及分布
1、剪取肝边缘较薄处组织1小块，放在凹玻片凹槽中， 用生理盐水反复浸泡冲洗以除去血液； 2、将凹玻片放在37℃恒温葙（为什么？），滴2滴 1/5000健那绿生理盐水液，注意不可将组织完全 淹没，使组织边缘染成蓝绿色即可，一般需2剖剪剪取 组织块边缘着色部位，放入生理盐水中，剪碎后压 片观察，画图示肝细胞及其中线粒体形态、分布。
活体染色常用染料
詹纳绿－线粒体（体外活染） 亮焦油紫－线粒体（体内活染） 中性红－液泡系（体内体外兼可） 次甲蓝－神经组织 尼罗蓝（Nile Blue）－原生动物大核
实验目的
了解常用活体染色剂及使用方法 通过活体染色了解细胞的结构和功能
液泡系和线粒体的活体染色
液泡系和线粒体的活体染色
实验目的 掌握动、植物细胞活体染色的原理 和相关的技术。
液泡系和线粒体的活体染色
1.仪器、用具 2.材料 人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎、牛蛙、黄豆根 尖 3.试剂 Ringer溶液、1%和1/3000中性红溶液、 1%和1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液
液泡系和线粒体的活体染色
液泡系和线粒体的活体染色
液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十 分重要的功能。中性红是液泡的特殊染色剂， 只将液泡染成红色。在细胞处于生活状态时， 细胞质和细胞核不被中性红染色。 线粒体是细胞内的一个重要细胞器，是细 胞进行呼吸作用的场所。詹纳斯绿Ｂ对线粒体 具有专一性的染色，是毒性最小的碱性染料。 詹纳斯绿Ｂ染色是由于线粒体中的细胞色素氧 化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态，呈 现蓝绿色，而周围的细胞质被还原成无色的色 基。
液泡系和线粒体的活体染色
洋葱鳞茎细胞液泡的活体染色 撕取洋葱鳞茎内表皮。 1/3000中性红溶液染色5-10mm。 吸去染液，滴加Ringer液。 盖片，镜检。
液泡系和线粒体的活体染色
作业
实验报告，观察
牛蛙胸骨剑突软骨细胞的液泡系活体染 色观察 解剖牛蛙，剪取胸骨剑突软骨最薄的 部分。 取材料一小块，放入载玻片中央，用 1/3000中性红染液中，染色5-10mm。 吸去染液，滴加Ringer液。 盖片，油镜下观察。
液泡系和线粒体的活体染色
黄豆根尖细胞液泡系的活体染色 将黄豆根尖切一薄的纵切面。 1/3000中性红溶液染色5-10mm。 吸去染液， 加Ringer液。 盖片，并用镊子轻轻地下压盖玻片， 使根尖压扁。 高倍镜下镜检。
詹纳斯绿b染色是由于线粒体中的细胞色素氧化酶系的作用使染料始终保持氧化状态呈现蓝绿色而周围的细胞质被还原成无色的色实验目的掌握动植物细胞活体染色的原理和相关的技术
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中性红染色液(液泡系专用)
简介：
中性红是一种弱碱性pH 指示剂，变色范围在pH6.4～8.0之间(由红变黄)。
分子式为C 15H 16N 4·HCl ，分子量为288.78。
在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌。
动物细胞内由单层膜包裹的小泡属于液泡系，如溶酶体、高尔基复合体、内质网、吞噬泡、转运泡等，尤以软骨细胞的液泡系发达。
Leagene 中性红染色液(液泡系专用)呈中性，是一种组织或细胞的液泡系的专一性活体染色剂，活细胞染色时只能将液泡系染成红色，细胞质和细胞核不会着色。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 短脊髓处死蟾蜍或其他动物，固定于腊盘上，剪开腹腔，取剑突软骨最薄弱部分的一小片，置于洁净载玻片上。
2、 滴加中性红染色液(液泡系专用)完全覆盖样本染色。
3、 用吸水滤纸沿玻片周围吸去染色液。
4、 滴加Ringer buffer ，盖上盖玻片，用滤纸从盖玻片侧面吸去多余液体。
5、立即镜下观察或拍照。
染色结果：
软骨细胞呈椭圆形；液泡系为大小不一的小泡，呈玫瑰红色。
注意事项：
1、 中性红染色液长期存放会产生少量沉淀，一般不影响使用。
2、 首次使用本试剂时建议先取1~2个样品做预实验。
3、 中性红染色液时，可以根据染色结果和要求调整时间。
4、 对于活体染色，应注意保持样本的活体状态，尤其是在取材时应做到准确、快速。
5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 DA0075 Storage 试剂(A): 中性红染色液(液泡系专用) 100ml 4℃ 避光 试剂(B): Ringer buffer 250ml 4℃ 使用说明书 1份
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