ISSR通用引物序列
ISSR分子标记及其在植物遗传育种中的应用
２０世纪８０年代中期以来，由于ＰＣＲ技术的出现，基于ＰＣＲ技术的分子标记，如随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）、微卫星（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）或称简单序列重复（ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）、扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）等受到广泛重视和应用。
ＳＳＲ标记技术根据微卫星序列两侧的保守序列设计引物，对串联重复的微卫星序列进行ＰＣＲ扩增，结果可以显示出ＳＳＲ拷贝数的差异，该技术重复性和稳定性都较好，被广泛用于遗传作图、种质鉴定等研究中（ＳｅｎｉｏｒａｎｄＨｅｕｎ，１９９３；ＷｕａｎｄＴａｎｋｓｌｅｙ，１９９３）。
但由于ＳＳＲ两侧引物具有物种特异性，具体实验中引物设计费时耗力，这在一定程度上阻碍了该技术的广泛应用（Ｋｏｊｉｍａｅｔａｌ，１９９８）。
ＩＳＳＲ（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ）又称简单重复序列间扩增，是在ＳＳＲ基础上发展起来的一类新型的分子标记技术，其引物开发费用低，具有操作简单，比ＲＡＰＤ和ＲＦＬＰ能揭示更高的多态性，目前，ＩＳＳＲ标记已广泛地用于遗传作图、品种鉴定、遗传多样性、基因定位、系统发育、分子标记育种等方面。
１ＩＳＳＲ技术原理及特点植物基因组中分布有大量的重复序列，根据其在基因组中的含量可分为轻度、中度和高度重复序列，根据其分布特征可分为散在重复序列和串联重复序列，ＳＳＲ是一种高度串联重复序列，重复基序为２～６ｂｐ，分布于常染色质区，是真核生物基因组重复序列的主要组成部分，均匀分布于基因组中（何平，１９９８），正是基于基因组的这种特点，才出现了ＳＳＲ和ＩＳＳＲ技术。
ＩＳＳＲ是基于ＳＳＲ发展起来的一种新型分子标记技术，它的基本原理就是在ＳＳＲ的３’端或５’端加锚１～４个嘌呤或嘧啶碱基，并以此作为引物，通常为１６～１８个碱基序列，对两侧具有反向排列ＳＳＲ的一段ＤＮＡ序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间ＩＳＳＲ标记的多态性。
中国兰ISSR—PCR反应体系优化及引物筛选
中国兰ISSR—PCR反应体系优化及引物筛选作者：黄晓慧巫伟峰陈春张毅智汪长水徐建球陈发兴陈孝丑来源：《南方农业学报》2018年第07期摘要：【目的】优化中国兰的ISSR-PCR反应体系，并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物，为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考。
【方法】以6个中国兰品种为材料，采集其叶片样品，分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨，比较两种方法提取DNA的效果，利用L25（53）正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化，建立最佳ISSR-PCR 反应体系，并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物。
【结果】研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法，但二者提取的DNA质量均较好（OD260/OD280为1.7～2.0）。
对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量。
综合考虑成本和DNA模板量，最佳ISSR-PCR反应体系（20.0 μL）：DNA模板10.0 ng、引物0.8 μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0 μL。
最佳循环数为35，最佳退火温度为49.6 ℃。
基于上述优化结果，从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物。
【结论】研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量，且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物，扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。
关键词：中国兰；ISSR；分子标记；反应；引物筛选中图分类号： S682.310.36 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1282-070 引言【研究意义】中国兰又称国兰，是中国传统兰花的统称，为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物，其味幽香，花色淡雅，素有花中君子和天下第一香之美称，且具有独特的内涵和意境，观赏和经济价值很高（陈心启，2011）。
龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选
龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选【摘要】本研究旨在通过对龙头鱼ISSR-PCR多态性引物的筛选，确定最佳退火温度，从而为龙头鱼的遗传多样性研究提供参考。
通过PCR实验方法的应用，对引物的退火温度进行了筛选，并对结果进行了分析和讨论。
影响因素的分析有助于深入了解龙头鱼的遗传特征。
研究表明，龙头鱼ISSR-PCR多态性引物在特定退火温度下表现出更好的多态性。
最终得出结论，为龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的筛选提供了总结，并展望未来进一步研究的方向。
本研究为龙头鱼遗传多样性研究提供了重要的实验基础和理论指导。
【关键词】龙头鱼、ISSR-PCR、多态性、引物、退火温度、筛选、实验方法、结果分析、讨论、影响因素分析、总结、展望、研究背景、研究目的1. 引言1.1 研究背景龙头鱼（Ophicthius rhodochrous）是一种重要的经济水产品，广泛分布于东海、南海等海域。
随着海洋环境的污染和气候变化加剧，龙头鱼的生存环境受到了严重威胁，其遗传多样性逐渐减少，种群数量逐渐下降。
研究龙头鱼的遗传多样性和种群结构对于有效保护和合理利用龙头鱼资源具有重要意义。
ISSR-PCR是一种基于多态性的分子标记技术，能够快速、准确地检测遗传多样性和种群结构。
针对龙头鱼的ISSR-PCR分析，需要选取合适的引物并确定最佳的退火温度，以确保实验的准确性和稳定性。
目前关于龙头鱼ISSR-PCR多态性引物最佳退火温度的研究还比较缺乏，为了更好地开展龙头鱼遗传多样性研究，有必要对相关技术进行进一步优化和改进。
本研究旨在筛选龙头鱼ISSR-PCR多态性引物的最佳退火温度，为后续研究提供可靠的实验基础。
1.2 研究目的本研究的目的是确定龙头鱼ISSR-PCR多态性引物的最佳退火温度，以提高PCR反应的特异性和灵敏度，进一步优化龙头鱼的遗传育种工作。
通过筛选出最适合的退火温度，可以有效地降低PCR反应的非特异性扩增和杂交，同时提高PCR扩增产物的稳定性和重复性，为龙头鱼遗传多样性的研究和育种工作提供更可靠的数据支持。
ISSR分子标记及其在植物分子生物学中的应用_陈龙
收稿日期:2007206225基金项目:蚌埠学院科研项目资助(BBXY 20062204A )。
作者简介:陈 龙(1983-),男,安徽庐江人;助教,主要从事食品与生物工程方面的研究。
I SS R 分子标记及其在植物分子生物学中的应用陈 龙, 王家良, 杨贤松(蚌埠学院食品与生物工程系, 安徽蚌埠233030)I SSR Poly mor phis m and Its App licati on in Plant Molecular B i ol ogyCHEN L ong,W ANG J i a 2li a ng,YANG X i a n 2song摘要:I SSR 分子标记是在PCR 基础上发展起来的一种DNA 多态性检测技术。
其基本原理就是在SSR 的3’或5’端锚定1～4个核苷酸,然后对反向排列SSR 间的一段DNA 进行PCR 扩增,而不是扩增SSR 本身。
I SSR 分子标记通常为显性标记,呈孟德尔式遗传,具有简便、快速、稳定、DNA 多态性高等优点。
目前,在植物遗传多样性、系统发育、品种鉴定、基因定位、遗传作图等研究中已得到广泛的应用。
关键词: I SSR;植物分子生物学;应用中图分类号: Q7;S339.3+1 文献标志码: A 文章编号: 100124705(2007)102004920420世纪90年代以来,基于PCR 的DNA 分子标记,如随机扩增多态性DNA (random a mp lified poly mor 2phis m DNA,RAP D )、扩增片段长度多态性(a mp lified frag ment length poly mor phis m ,AF LP )、简单重复序列(si m p le sequence repeat,SSR )又称之为微卫星(m icr o 2satellite )等在植物研究中得到广泛应用[1]。
但RAP D重复性低,AF LP 费用昂贵,SSR 引物设计费时耗力,使得它们的应用受到一定程度的限制。
常用引物序列
常用引物序列引言引物序列是指在分子生物学实验中用来特异性引导DNA或RNA复制和扩增的短链核酸序列。
常用的引物序列在科研和实验室工作中起着重要作用。
本文将介绍几种常用引物序列及其在实验中的应用。
1. 通用引物序列通用引物序列是指适用于多种物种的引物序列。
常见的通用引物序列包括16S rRNA引物序列用于细菌和古细菌的分析，18S rRNA引物序列用于真核生物的分析，以及ITS引物序列用于真菌的分析。
这些通用引物序列具有高度保守性，可以用于不同物种的物种鉴定和进化分析。
2. 物种特异引物序列物种特异引物序列是指只在特定物种中存在的引物序列。
这些引物序列通常用于物种鉴定和种群遗传分析。
例如，人类特异引物序列可以用于人类DNA的特异扩增，从而进行人类个体的鉴定。
物种特异引物序列的选择和设计需要根据目标物种的基因组序列进行。
3. 定量引物序列定量引物序列是指用于定量PCR实验的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以通过PCR扩增目标基因的特定片段，并通过实时荧光定量PCR技术进行定量分析。
定量引物序列的设计需要考虑引物的特异性和扩增效率，以确保准确的定量结果。
4. 荧光标记引物序列荧光标记引物序列是指在引物序列上加入荧光标记分子，用于检测和定量特定基因的表达水平。
常用的荧光标记引物序列包括荧光探针和荧光引物。
荧光标记引物序列可以通过荧光定量PCR或原位杂交等技术进行检测。
5. 反向引物序列反向引物序列是指用于反转录PCR实验的引物序列。
反转录PCR是一种将RNA转录成cDNA的技术，常用于研究基因的表达调控和mRNA的定量分析。
反向引物序列通常与反向转录酶结合，将RNA逆转录成cDNA，并通过PCR扩增特定基因的cDNA片段。
6. 基因特异引物序列基因特异引物序列是指用于特定基因扩增的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以选择性地扩增目标基因，从而进行基因型鉴定和基因表达分析。
虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选
虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【摘要】22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL),2μL 10×PCRBuffer(mg2+ plus),1.5 μL dNTP (2.5 mmol/L),1.5 μL引物(10 pmol/μL),50 ng模板DNA,ddH2O补足体积.以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条.引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃.12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81％.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】7页(P1-6,11)【关键词】虉草;ISSR-PCR反应体系;引物筛选【作者】张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【作者单位】内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042【正文语种】中文【中图分类】S543;Q786虉草(Phalaris arundinacea)，属于禾本科(Gramineae)、虉草属植物，别名草芦、园草芦。
主要分布于欧洲、北美和亚洲，在我国主要分布于东北、华北、华中、华东等地区。
虉草耐盐碱、耐湿涝，又耐旱，生长快，营养繁殖能力强，产草量高、叶量丰富，蛋白质含量高，被广泛用于饲草、人工湿地植物、生物能源材料或造纸原料等[1-2]。
李种质资源ISSR反应体系引物筛选
安佰义，王 迦，王 ?，等．李种质资源ＩＳＳＲ反应体系引物筛选［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（１０）：６３－６５．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．１０．０１４李种质资源ＩＳＳＲ反应体系引物筛选安佰义１，王 迦１，王 ?１，于慧颖１，范爱淇１，张艳波２，张 艳３，李 锋２（１．吉林农业大学园艺学院，吉林长春１３０１１８；２．吉林省农业科学院果树研究所，吉林长春１３００３３；３．吉林省农业科学院，吉林长春１３０１２４） 摘要：以李１８个品种种质资源为试验材料，对其开展ＩＳＳＲ反应体系引物筛选，结果表明，从４１个随机引物中筛选出２５个多态性引物用于ＰＣＲ扩增，每个多态性引物扩增出的条带数在８～２３条之间，扩增出的ＤＮＡ片段长度大多在１５０～２４００ｂｐ之间；共扩增出条带数为３８５条，其中，样品间相同的条带数有５３条；所选引物的多态位点百分率为８６．２３％。
关键词：李；种质资源；ＩＳＳＲ；引物；多态位点 中图分类号：Ｓ６６２．３０２．４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１９）１０－００６３－０３收稿日期：２０１８－０１－３１基金项目：吉林省重点科技攻关项目（编号：２０１６０２０４０３１ＮＹ）。
作者简介：安佰义（１９７８—），男，山东日照人，博士，副教授，从事园林植物种质资源及栽培生理研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｌｉ１０４３７＠１２６．ｃｏｍ。
区间简单重复序列标记（ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）是一种微卫星基础上的第２代分子标记技术，其基本原理是用锚定的微卫星ＤＮＡ为引物，在简单重复序列（ＳＳＲ）的３′端或５′端各加２～４个非重复随机核苷酸序列作为引物，在聚合酶链式反应（ＰＣＲ）中锚定引物可引起特定位点退火，并对重复序列间的ＤＮＡ片段进行ＰＣＲ扩增［１－３］。
ＩＳＳＲ标记结合了随机扩增多态性ＤＮＡ标记（ＲＡＰＤ）、ＳＳＲ技术的优点，具有模板ＤＮＡ用量少、引物设计简单、成本低、ＰＣＲ扩增产物多态性丰富、产物重复性和稳定性好、试验安全性较高及技术难度较低等特点［４］，现已在植物遗传作图、基因定位、品种鉴定、遗传多样性及亲缘关系分析等方面被广泛应用［５－９］。
ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记的实验原理及操作流程
ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记的实验原理及操作流程ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR 标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
关键词：标记分子ISSRinter-simplesequencerepeatSSR引物RAPD分子标记单寡聚核酸ISSR标记ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。
用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。
一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul)。
二、实验设备PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。
三、试剂1、ISSR引物：购买成品或根据加拿大British Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。
2、Taq酶3、10xPCR 缓冲液4、MgCl2：25mmol/L。
5、dNTP：2.5mmol/L。
四、操作步骤：1. 在25ul反应体系中，加入模板DNA 1ul (30-50ng)ISSR引物1ul (约5pmol)10xPCR Buffer 2.5ulMgCl22uldNTP 2ulTaq酶1单位（U）加ddH2O 至25ul混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。
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ISSR通用引物序列
UBC Primer Set #9 (Microsatellite) 引物名称序列
801 ATA TAT ATA TAT ATA TT
802 ATA TAT ATA TAT ATA TG
803 ATA TAT ATA TAT ATA TC
804 TAT ATA TAT ATA TAT AA
805 TAT ATA TAT ATA TAT AC
806 TAT ATA TAT ATA TAT AG
807 AGA GAG AGA GAG AGA GT
808 AGA GAG AGA GAG AGA GC
809 AGA GAG AGA GAG AGA GG
810 GAG AGA GAG AGA GAG AT
811 GAG AGA GAG AGA GAG AC
812 GAG AGA GAG AGA GAG AA
813 CTC TCT CTC TCT CTC TT
814 CTC TCT CTC TCT CTC TA
815 CTC TCT CTC TCT CTC TG
816 CAC ACA CAC ACA CAC AT
817 CAC ACA CAC ACA CAC AA
818 CAC ACA CAC ACA CAC AG
819 GTG TGT GTG TGT GTG TA
820 GTG TGT GTG TGT GTG TC
821 GTG TGT GTG TGT GTG TT 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG
843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC 845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG 846 CAC ACA CAC ACA CAC ART 847 CAC ACA CAC ACA CAC ARC 848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 850 GTG TGT GTG TGT GTG TYC 851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA 853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT 854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC 860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC 862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 863 AGT AGT AGT AGT AGT AGT 864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG
865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG 866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC 867 GGC GGC GGC GGC GGC GGC 868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA 869 GTT GTT GTT GTT GTT GTT 870 TGC TGC TGC TGC TGC TGC 871 TAT TAT TAT TAT TAT TAT 872 GAT AGA TAG ATA GAT A 873 GAC AGA CAG ACA GAC A 874 CCC TCC CTC CCT CCC T 875 CTA GCT AGC TAG CTA G 876 GAT AGA TAG ACA GAC A 877 TGC ATG CAT GCA TGC A 878 GGA TGG ATG GAT GGA T 879 CTT CAC TTC ACT TCA
880 GGA GAG GAG AGG AGA
881 GGG TGG GGT GGG GTG
882 VBV ATA TAT ATA TAT AT 883 BVB TAT ATA TAT ATA TA 884 HBH AGA GAG AGA GAG AG 885 BHB GAG AGA GAG AGA GA 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT
887 DVD TCT CTC TCT CTC TC
888 BDB CAC ACA CAC ACA CA
889 DBD ACA CAC ACA CAC AC
890 VHV GTG TGT GTG TGT GT
891 HVH TGT GTG TGT GTG TG
892 TAG ATC TGA TAT CTG AAT TCC C
893 NNN NNN NNN NNN NNN
894 TGG TAG CTC TTG ATC ANN NNN
895 AGA GTT GGT AGC TCT TGA TC
896 AGG TCG CGG CCG CNN NNN NAT G
897 CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G
898 GAT CAA GCT TNN NNN NAT GTG G
899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A
900 ACT TCC CCA CAG GTT AAC ACA
其中：N = (A ,G,C ,T) ,R = (A ,G) ,Y = (C ,T) ,B = (C ,G,T) ( I.e.not A) ,D = (A ,G,T)
( I.e.not C) ,H = (A ,C ,T) ( I.e.not G) ,V = (A ,C ,G) ( I.e.not T)。