第一篇 微生物检验基本技术
微生物检验(完整版)
微生物检验(完整版)微生物检验是一种用于检测和鉴定微生物的方法，它在医学、食品安全、环境保护等领域都有着重要的应用价值。
微生物检验可以帮助人们了解微生物的种类、数量、分布以及对人类和环境的影响，从而采取相应的控制和预防措施。
本文将从微生物检验的基本原理、常见方法和应用领域等方面进行介绍。
一、微生物检验的基本原理。
微生物检验的基本原理是通过对样品中的微生物进行分离、培养、鉴定和计数，从而得到微生物的种类和数量。
其主要包括以下几个步骤：1. 取样，首先需要从待检样品中取得适当的样品，如食品、水、空气、土壤等。
取样的方法和条件需根据具体的检验要求和标准来确定。
2. 分离，将样品中的微生物分离出来，通常采用的方法有稀释涂布法、滤膜法、过滤法等。
分离出的微生物可以进行后续的培养和鉴定。
3. 培养，将分离出的微生物进行培养，提供适当的营养物质和环境条件，促使微生物的生长和繁殖。
培养的时间和温度等条件需根据不同的微生物种类来确定。
4. 鉴定，对培养出的微生物进行形态学、生理学和生物化学特性等方面的鉴定，确定其种属和数量。
常用的鉴定方法有显微镜观察、生化试验、分子生物学方法等。
5. 计数，对培养出的微生物进行计数，得到微生物的数量。
常用的计数方法有平板计数法、膜过滤法、涂片计数法等。
二、微生物检验的常见方法。
微生物检验的常见方法主要包括传统方法和现代方法两大类。
1. 传统方法，传统方法主要包括涂布法、滤膜法、过滤法、薄层法等。
这些方法简单易行，成本低廉，适用于一般的微生物检验需求。
但传统方法通常需要较长的培养周期，且对微生物的种类和数量有一定的限制。
2. 现代方法，现代方法主要包括PCR法、蛋白质质谱法、流式细胞术等。
这些方法具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，能够快速准确地检测和鉴定微生物。
但现代方法的设备和技术要求较高，成本较高，适用于对微生物检验有较高要求的领域。
三、微生物检验的应用领域。
微生物检验在医学、食品安全、环境保护等领域都有着重要的应用价值。
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、样品的制备与处理1.样品的选择与采集：根据检验目的和要求，选择适当的样品，并根据采样规范进行取样。
比如，对食品的微生物检验，可以选择不同部位的样品，如表面、内部等；对饮用水的微生物检验，可以选择源头水、管网水等；对环境的微生物检验，可以选择空气、地表水等。
2.样品的保存与运输：为了避免样品中微生物的生长和变化，需要将样品保存在适当的条件下（如低温、暗处等）。
同时，在运输过程中，需要避免样品的污染和损坏。
3.样品的处理：样品处理过程通常包括样品的搅拌、过滤、稀释等。
搅拌可以均匀样品中的微生物分布；过滤可以去除样品中的固体颗粒；稀释可以将样品中微生物的浓度调整到适宜的浓度范围，以便后续的检测操作。
二、微生物的分离与纯化1.微生物培养基的选择：根据待检微生物的特性和对检测结果的要求，选择适当的培养基。
常用的培养基有通用培养基、选择性培养基和特殊培养基。
2.菌落计数：将经过处理的样品按照一定的稀释倍数进行均匀悬浮，并于培养基平板上进行接种。
经过一段时间的培养，可通过菌落的外观、形状、大小、颜色等来初步判断微生物的种类和数量。
3.纯化子菌株：从菌落中选取代表性菌落，通过反复传代培养，最终得到纯种菌株。
三、微生物的鉴定与鉴别1.形态学观察：通过显微镜观察微生物的形态特征，如细胞形状、大小、结构等，可以初步鉴定微生物的类别。
2.生理生化试验：通过微生物的代谢特性进行鉴定。
常用的生理生化试验包括氧需求性试验、酸碱反应试验、温度试验、营养需求试验、代谢产物试验等。
3.分子生物学手段：通过分子生物学技术，如聚合酶链反应（PCR）、DNA序列比对等，对微生物进行进一步的鉴定和鉴别。
例如，利用16SrRNA基因作为分子标志物，可以快速、准确地识别微生物种类。
四、微生物的计数与统计1.液体中微生物的计数：通过在培养基中逐级稀释样品，最后将稀释液接种于平板上，培养一段时间后，根据培养基中菌落的数量进行计数，以反推样品中微生物的浓度。
微生物检验技术基础知识
四、微生物限度检查法
5、方法验证 5.1验证菌株 大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌 、黑曲霉
5.2计数方法的验证 当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵 母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的 细菌、霉菌及酵母菌数的测定。 若产品的组分或原检验条件发生改变可影响检验结果时，计 数方法应重新验证。
微生物检验技术 基础知识
目 录
一、微生物基本介绍 二、培养基 三、菌种 四、微生物限度检查法
一、微生物基本介绍
1、微生物的定义
微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞、 甚至是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称。
2、微生物的分类
微生物的主要分类单位：域、界、门、纲、目、科、 属、种、变种、亚种（小种）、型、菌株（品系）
二、培养基
5、培养基的性能评估
所有购回的、配制好的培养基均应进行质量控制试验（培养 基适应性检查） 理化指标（P55） 微生物学指标（P55）
三、菌种
1、分类（概念）：
标 准 菌 株 标准储备菌株 商业派生菌株 工 作 菌 株 由国内或国际菌种保藏机构保藏的 由标准菌株经一次传代得到的培养物
一、微生物基本介绍
5、微生物与我们
每张人民币带细菌：900万个； 人体体表及体内存在大量的微生物； 皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米； 口腔“细菌种类超过500种； 肠道：微生物总量达100万亿；
一、微生物基本介绍
（未清洗的手）
（凉水洗的手）
（洗洁精洗后的手）
（洗洁精洗后，消毒剂消毒的手）
谢谢大家！
四、微生物限度检查法
第一章微生物检验基本知识
第一章微生物检验基本知识包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。
接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。
微生物检验基本技能
微生物及免疫学科组
内 容
•
•
无菌技术
安全要求
•
•
微生物分离培养（细菌）
微生物保藏
微生物检验技术
1.形态学检测技术（染色、镜检技术） 3.基于生理生化特征的检测技术
2.培养特征检测技术（计数、生长性状） 4.致病性检测技术
5.药物敏感性检验技术 6.血清学检测技术
微生物检验技术
细菌的培养基及性状观察
厌氧罐
三、细菌的分离培养及性状观察
在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。 从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是 指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁 殖而产生的后代。 分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂 菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中 分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养 物移植培养。
无机盐的生理功能
细胞内一般分子成分（P、S、Ca、Ma 、Fe等） 一般功能 渗透压的维持（Na+等）
生理调节物质
大量元素 无
酶的激活剂（M a2+等）
pH的稳定
化能自养菌的能源（S、Fe2+、NH4+、NO2-等）
机
盐
特殊功能
无氧呼吸时的氢受体（NO3-、SO42-等） 酶的激活剂（Cu2+、Mn2+ 、Zn2+等）
一、菌种保藏
现行的菌种保藏方法有下列诸种: (一)低温保藏法 (二)低温定期移植法 (三)石蜡油低温保藏法 (四)干燥保藏 (五)甘油管保藏法 (六)真空冷冻干燥法 (七)液氮超低温保存
低温保藏菌种
低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。 在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。 在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度
微生物检验的基本操作技术
微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。
2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。
包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。
包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。
3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。
严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。
倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。
二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；（2）无菌室的消毒和防污染•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。
（3）无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。
微生物检验的操作技术
1个
灭菌吸管
根据需要
1瓶
电子称
1台
1个
250ml灭菌三角 瓶
2个
1个
培养基
根据需要
1支
混匀器
1台
三、无菌操作的基本技术
1、无菌接种操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具 （如接种针和吸管等）在无菌条件下接种 含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于 培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。
在实验室检验中的各种接种必须是无 菌操作。
2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物 的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏 蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器 皿灭菌、操作方法等。
3.无菌操作原则
1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌 区，接种时必须穿工作服、戴工作帽应在进无菌室前用 肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；
二、无菌操作的环境要求
• 无菌室 • 超净工作台 • 无菌器材
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间； （2）无菌室的消毒和防污染 • 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）； • 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）； • 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进
行消毒。
（3）无菌室使用要求
无菌操作技术
无菌操作
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
2、微生物检验过程中的无菌操作要求
（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放； （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准； （6）、不能用嘴直接吸吹吸管； （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%
微生物检验基本技术—无菌技术
（2）灭菌和消毒
消毒：用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝大 多数微生物的措施，实际上是部分灭菌。例如，酒 精擦拭。
灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外所有微 生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。
干热灭 菌 湿热灭菌
灭 菌
过滤除菌
紫外线杀菌
化学药剂杀菌
其中高压蒸汽灭菌是微生物学研究和教学中应用最广泛、 效果最好的湿热灭菌方法。
桶内消毒； ⑧操作时禁止再培养物上方移动手臂；
（2）接种 1、接种的一般流程 接种工具灭菌 防止污染标本 接种工具冷却
沾取标本
接种
接种工具灭菌 防止污染环境
2、到平板
3、斜面接种技术
斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。
用于好气性微生物的接种。
具体操作： ①贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等，贴在距试管口 约2到3厘米处，也可使用记号笔标记。 ②点燃酒精灯。 ③接种： 1）手持试管 将菌种管和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部 位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。
斜面接种示意图
4、液体接种 具体操作： 与斜面接种基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与 管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上试管塞再轻轻摇匀。 如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。
5、划线接种 目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、 活菌计数。 方法： ①分区划线法：适用于含菌量较多的标本 ②连沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培 养基底部向上作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基。有时也可用接 种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不 同菌种的生长特点。
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第一章细菌检验基本技术
一、形态学检查
意义：1.为后续的进一步检验提供参考依据
2.迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况
3.对少数具有典型形态特征的细菌可以做出初步诊断，为临床选用抗菌
药物治疗起重要的提示作用。
分为：染色标本和不染色标本的检查
1、不染色标本的检查：用于观察细菌的动力及运动情况。
常用方法有压滴法和悬滴法。
2、染色标本检查：检查的内容：对标本合格与否进行评价；了解标本有无细菌及大致菌量；根据细菌形态、染色性质等对病原菌初步识别分类，决定进一步的生化反应鉴定血清学鉴定、并为临床选择用药提供帮助。
常用染色方法有：革兰染色（常用）、抗酸染色（结核病、麻风病）、荧光染色（结核、麻风、白喉、痢疾）、负染色（墨汁负染色法用于新型隐球菌检查）、特殊染色（鞭毛染色、荚膜染色、异染颗粒（白喉））。
二、培养与分离技术（关键）
目的：鉴定细菌的种类和保存菌种，为进一步确定细菌的致病性、药物敏感性提供依据。
牛肉膏无糖，可作为肠道细菌鉴别培养基的基础成分。
流感嗜血杆菌需要X因子和V因子。
理想的凝固物质具有的特性：本身不被细菌利用；在微生物生长温度范围内保持固体状态，凝固点的温度对微生物无害；不因消毒灭菌而破坏，透明度好，黏着力强。
（琼脂最合适）
半固体培养基琼脂含量 0.3%~0.5%；固体培养基1.5%~2.0%。
培养基质量检验：1、无菌试验：将灭菌后的培养基置35℃温箱培养过夜，判定是否灭菌合格。
2、效果检验：按不同的培养要求，接种相应菌种（符合要求的标准菌种），观察细菌的生长、菌落形态、色素、溶血及生化反应等特征，判断培养基是否符合要求。
制备好的培养基存放于冷暗处或4℃冰箱，一般不超过七天，如果用塑料袋密封。
保存期可延长，但至多两周。
专性需氧：结核分枝杆菌、霍乱弧菌
微需氧菌（5%氧气、10%二氧化碳、85%氮气）：空肠弯曲菌，幽门螺杆菌兼性厌氧菌：大多数病原菌
专性厌氧菌：破伤风梭菌、脆弱拟杆菌
二氧化碳培养（5%~10%二氧化碳）：淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌
菌落是单个细菌在培养基上分裂繁殖而成的肉眼可见的细菌集落。
菌苔是由众多菌落连接而成的细菌群落。
三、生物化学鉴定技术
1、碳水化合物代谢试验
2、蛋白质和氨基酸代谢试验
3、碳源利用试验
4、呼吸酶类试验
5、其他
重点：触酶试验：区分葡萄球菌（+）和链球菌（-）
氧化酶试验：区分弧菌科、非发酵菌（+）和肠杆菌科（-）
四、非培养检验技术（对于培养时间长或难以培养的细菌以及细菌毒素、耐药基因等）
1、免疫学检验技术：抗原检测和抗体检测
2、分子生物学检验技术：核酸杂交技术、聚合酶链反应、生物芯片技术
3、细菌毒素检验技术：内毒素（革兰阴性菌）、外毒素（革兰阳性菌）
4、降钙素原检验技术
5、动物实验
五、细菌检验自动化
1、微生物标本前处理系统及自动染色系统
2、自动血液培养系统、
3、自动化细菌鉴定药敏系统
4、微生物医院内感染分析系统
5、微生物实验室信息化、
6、微生物自动化检验系统进展。