植物遗传转化大实验
烟草遗传转化实验报告
烟草遗传转化实验报告实验目的烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系｡本实验以烟草为实验材料,了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤, 掌握遗传转化的基本操作技术｡实验要求:掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法;理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理:了解转基因植物筛选的方法｡实验原理:根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌,根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒,简称为Ti质粒｡野生型农杆菌的Ti质粒,含有两个与致瘤有关的区域: 一个是T-DNA区,含致瘤基因;另一个是毒性区,在T-DNA的切割､转移与整合过程中起作用｡用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建,是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除,并在T-DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点｡p BI121载体是常用的植物表达载体,载体的骨架是pUC18,以CaMV3SS启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素(kan) 抗性选择标记基因,含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因｡β一葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因,转化的获得的转基因细胞､组织或植株,具有抗卡那霉素的特性,经组织化学染色呈蓝色｡实验器材摇床､超净工作台､小型离心机､冰箱､移液抢､镊子､手术刀､酒精灯､棉球､培养皿､三角瓶､滤纸､牛皮纸､牙签｡实验材料植物材料:烟草无菌苗农杆菌与载体:农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基:牛肉膏(5 g/L)､蛋白胨(5 g/L)､酵母提取物(1 g/L)､蔗糖(5 g/L)､MgSO4(0.5g/L)､pH 7.0烟草分化培养基: MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA烟草生根培养基: MS + 0.5mg/L IAA卡那霉素(Kan) 母液: 50mg/ml, 过滤除菌,分装,-20°C保存｡头孢霉素(cef) 母液: 300mg/ml, 过滤除菌,分装,-20"C 保存｡利福平(rif): 50mg/ml,过滤除菌,分装,-20"C保存｡。
胡萝卜的植物学实验报告
一、实验目的1. 了解胡萝卜的植物学特征，包括根、茎、叶等器官的结构和功能。
2. 学习植物组织培养技术，掌握胡萝卜愈伤组织的诱导、继代增殖和细胞悬浮培养方法。
3. 了解胡萝卜细胞悬浮培养的遗传转化和抗性筛选技术。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：胡萝卜种子、MS培养基、植物激素、抗生素等。
2. 实验仪器：超净工作台、显微镜、高压蒸汽灭菌器、培养箱、移液器、剪刀、镊子等。
三、实验方法1. 胡萝卜种子萌发实验（1）将胡萝卜种子用70%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次。
（2）将消毒后的种子播种于含有1/2MS培养基的发芽盒中，置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。
（3）观察胡萝卜种子发芽过程，记录发芽率、发芽时间等数据。
2. 胡萝卜根、茎、叶结构观察实验（1）取胡萝卜根、茎、叶样本，用FAA固定液固定。
（2）制作切片，进行染色。
（3）观察显微镜下的胡萝卜根、茎、叶结构，记录观察结果。
3. 胡萝卜愈伤组织诱导实验（1）将胡萝卜根切成小块，用70%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次。
（2）将消毒后的胡萝卜根块接种于含有植物激素（如NAA、IBA）的MS培养基中。
（3）将培养皿置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。
（4）观察愈伤组织形成过程，记录愈伤组织形成时间、愈伤组织颜色等数据。
4. 胡萝卜细胞悬浮培养实验（1）将愈伤组织剪碎，接种于含有植物激素（如NAA、IBA）的MS培养基中。
（2）将培养皿置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。
（3）观察细胞悬浮培养过程，记录细胞悬浮培养时间、细胞悬浮培养密度等数据。
5. 胡萝卜遗传转化实验（1）将细胞悬浮培养物接种于含有遗传转化质粒的培养基中。
（2）将培养皿置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。
（3）观察转化细胞生长情况，记录转化率。
6. 胡萝卜抗性筛选实验（1）将转化细胞接种于含有抗生素的培养基中。
（2）观察转化细胞在抗生素培养基中的生长情况，筛选出抗性细胞。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
叶盘法遗传转化
叶盘法遗传转化引言：叶盘法遗传转化是一种常用的植物遗传转化技术，它通过利用植物叶片的自愈能力和再生能力，将外源基因导入植物细胞，并使其整合到植物基因组中，从而实现对植物性状的改良。
本文将从叶盘法遗传转化的原理、方法和应用等方面进行详细介绍。
一、叶盘法遗传转化的原理叶盘法遗传转化的原理是利用植物叶片的再生能力和自愈能力，通过外源基因的导入和整合，使其在植物细胞中表达。
具体步骤如下：1. 取一片健康的植物叶片，并进行消毒处理，以杀灭表面的微生物。
2. 将消毒后的叶片切成小块，并将其培养在含有适当营养物质的培养基中。
3. 在培养基中添加适量的激素和外源基因载体。
4. 经过一段时间的培养，叶片的细胞会开始分裂和再生，形成愈伤组织。
5. 外源基因载体会通过一系列的转化步骤，被叶片细胞摄取和整合到植物基因组中。
6. 对愈伤组织进行筛选和培养，最终可以得到具有外源基因的转基因植株。
二、叶盘法遗传转化的方法叶盘法遗传转化有多种方法，常用的有以下几种：1. 再生性愈伤组织法：通过将叶片切成小块，培养在含有激素的培养基中，使其形成愈伤组织，并利用该组织进行基因转化。
2. 高速转化法：通过利用高速离心的力量，将外源基因载体直接注入叶片细胞中，实现基因转化。
3. 生物弹射法：通过利用微粒轰击或金属颗粒的瞬时加速度，将外源基因载体注入叶片细胞中。
4. 冷冻法：将叶片细胞与外源基因载体混合后，经过低温冷冻和解冻处理，使基因载体进入叶片细胞。
三、叶盘法遗传转化的应用叶盘法遗传转化是一种常用的植物遗传转化技术，广泛应用于植物的基因工程研究和植物育种中。
具体应用如下：1. 基因功能研究：通过导入外源基因，可以研究特定基因在植物生长发育、代谢途径、抗逆性等方面的功能和作用机制。
2. 优质农作物的培育：通过导入外源基因，可以提高农作物的产量、抗病性、抗逆性和品质等性状，实现对农作物的品种改良。
3. 抗虫害和抗病害的培育：通过导入外源基因，可以使植物具有对特定虫害或病害的抗性，减少农药的使用，降低对环境的污染。
拟南芥的遗传转化
XU E SHU TA N TA O学术探讨拟南芥的遗传转化河南农业职业学院刘晓丽魏楠摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥；遗传转化；实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu⁃rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni⁃col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwet L－77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm 离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNase A和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
植物转化及转基因的检测
※从重组子中，提取DNA，进一步分析鉴定转化子。
表达载体构建
※将目的基因克隆到表达载体上，使之在新的遗传背景下实现功能表达。
植物基因工程的主要步骤
植物遗传转化
※ 用生物或物理方法将目的基因转入植物受体中
转基因植物的鉴定
※ 分子水平、个体水平、群体水平检测目的基因的遗传、表达及其稳定性
转基因作物的育种利用
从处于分蘖中期的供试转基因抗虫水稻植株上，随 机取三个粗壮分蘖剪取3-4cm长的叶片一片。将叶片 移置长玻璃管6.5cm×1.5cm）内经0.1g/l苯骈咪唑保 鲜液浸渍过的滤纸片上，每管分别接入5头刚孵化的蚁 螟，管口塞紧脱脂棉。自开始接虫后，第二、四、六、 八天分别考察或测定幼虫死亡率。期间向管内增添新 鲜的叶片。
对照
直链淀粉含量 %
9.7 10.9 9.6 9.9 9.2 9.3 9.6 10.4 8.9 8.9 10.8 9.2 12.8
比对照降幅 %
24.51 14.96 25.26 22.66 28.12 27.70 24.65 18.50 30.31 30.31 15.83 28.20
转基因株系的遗传分析及纯合
植物转化及转基因的检测
2021/4/8
福建省农业遗传工程重点实验室
基因工程的概念
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种 生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工 合成的方法获取基因，然后经过一系列切割， 加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将 其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的 过程.
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
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植物遗传转化大实验
一、实验目的与原理简介
农杆菌介导的遗传转化系统是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，农杆菌可浸染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至裸子植物。
转化植物细胞的农杆菌主要有两类，即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
已有研究表明，影响农杆菌介导植物基因转化的因素很多，农杆菌菌株、植物基因型和外植体、培养方法、不同的选择标记等因素都影响农杆菌介导的遗传转化。
目前报道已有许多植物通过农杆菌的遗传转化获得了转基因植株或毛状根。
二、发根农杆菌介导的遗传转化步骤
1．无菌组织的培养
取组培苗幼嫩叶片，在超净工作台中切成0.5x0.5cm的方块，并在叶片上刻痕，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养3周后作为受体。
在农杆菌浸染前，将愈伤组织在无菌条件下切割成小块在愈伤诱导培养基上分别预培养，增加受体细胞的活性进而提高转化率。
2．农杆菌的培养
在转化平板上挑取c58c1单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。
在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm, 10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右。
3．共培养
剪取无菌苗的叶片和茎段，放入发根农杆菌MS悬液中浸泡5min，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS上，光照培养2天。
4．毛状根的诱导和培养
将共培养的外植体转入到1/2 MS + Cef 500mg/L培养基上光照培养。
随时检测外植体的染菌情况，如出现细菌生长过多，须马上转移到新筛选培养基中培养。
20天左右即可长出毛状根，剪取毛状根，接种于1/2 MS + Cb 250mg/L培养基上暗培养数周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌筛选培养基中继代筛选。
三、毛状根的分子鉴定
1、毛状根基因组DNA提取。
（采用CTAB法小量提取）。
2、转化基因PCR鉴定。
四、实验说明
能否成功地获得转基因植物，取决于起始材料对农杆菌的感受性、对转化细胞形成的新生组织的选择能力以及中选组织的再生能力。
遗传转化时应该注意以下几点：
1、对农杆菌进行必要的诱导处理，注意培养条件、菌液浓度、侵染和共培养的
时间等，在提高瞬时表达的同时要防止细菌的过度生长；
2、对再生植株的细胞起源需有明确的了解，在培养方法、培养基的设计上要有
利于转化细胞的生长、分裂及植株再生；。