实验硫酸苯酚法测多糖含量
多糖含量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖含量测定的原理和方法。
2. 熟悉实验仪器的操作。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理多糖是一类由多个单糖分子通过糖苷键连接而成的生物大分子。
多糖含量测定常用的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。
本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，其原理是：在酸性条件下，多糖与苯酚发生缩合反应，生成紫色化合物，通过比色法测定其吸光度，从而计算出多糖含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准葡萄糖溶液（浓度已知）- 标准多糖溶液（浓度已知）- 待测多糖样品- 苯酚、硫酸、盐酸等试剂2. 实验仪器：- 紫外可见分光光度计- 电子天平- 恒温水浴锅- 移液器- 离心机- 烧杯、试管、容量瓶等四、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取7支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL标准葡萄糖溶液，用蒸馏水定容至1mL。
- 每支试管加入0.5mL苯酚-硫酸混合液，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
- 取出冷却，加入5mL蒸馏水，混匀。
- 以蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 测定待测多糖样品：- 取3支试管，分别加入0.1mL待测多糖样品、0.1mL标准多糖溶液和0.1mL 蒸馏水，用蒸馏水定容至1mL。
- 每支试管加入0.5mL苯酚-硫酸混合液，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
- 取出冷却，加入5mL蒸馏水，混匀。
- 以蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度。
3. 计算待测多糖含量：- 根据待测多糖样品的吸光度，从标准曲线中查得相应的葡萄糖浓度。
- 根据待测多糖样品的体积和浓度，计算待测多糖含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R²=0.999。
2. 待测多糖含量的测定：- 待测多糖样品的吸光度为0.632，查得相应的葡萄糖浓度为0.5mg/mL。
3. 待测多糖含量的计算：- 待测多糖含量为0.5mg/mL。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚硫酸法测多糖
采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[10-11]。
标准曲线的制作：精确称取经干燥至恒重的标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至100mL，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以蒸馏水补至2mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0mL，再迅速加入浓硫酸5.0mL，水浴15分钟后显色彻底，在冷水中冷却，至室温后在波长490nm处测定吸光度，以水代替糖溶液作空白对照，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标制作标准曲线。
样品测定：取定容液1mL于试管中，稀释10倍即加入蒸馏水9mL得样品液，吸取该多糖样品溶液1mL按标准曲线制作步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算多糖含量。
表2 葡萄糖标准曲线设计方案
根据以上表格数据作葡萄糖标准曲线，如下：。
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖是一种常用的多糖测定方法，其原理基于多糖与硫酸苯酚反应产生显色化合物的特性。
在测定中，首先将待测样品中的多糖加入到试管中。
然后，向试管中逐渐加入浓硫酸，并快速而彻底地混合。
硫酸的加入会引发多糖与硫酸之间的酸水解反应，生成大量的醛基。
随后，加入苯酚试剂，苯酚与醛基反应生成的有色化合物会根据多糖的种类和含量而呈现出不同的颜色。
颜色的深浅可以通过分光光度计进行测量，从而得到多糖样品中多糖含量的定量结果。
该方法的优点是简单、快速，且对多糖具有较好的选择性。
然而，需要注意的是，在进行测定时应严格控制硫酸和苯酚试剂的加入量和混合程度，以避免反应过程中的误差产生。
总结起来，硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，通过多糖与硫酸和苯酚的反应生成有色化合物来实现多糖的测量。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
硫酸苯酚法测多糖
一、总糖含量标准曲线的绘制
准确称取无水葡萄糖10 mg，溶解后转入100 mL容量瓶定容。
按表4所示操作。
表4 总糖含量标准曲线绘制方法
管号0 1 2 3 4 5
标准葡萄
糖溶液
（mL）
0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8
蒸馏水
（mL）
2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 6%苯酚各1.0 mL
浓硫酸各5.0 mL
检测
摇匀后沸水加热10 min，冷却至室温后于490 nm处以0号管为空白对照，测光密度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线：Y=aX+b（Y为吸光值,X为葡萄糖质量/ug）。
二、试液总糖含量的测定
用移液枪从总体积V中吸取一定体积V1ml的待测液，用蒸馏水补至体积为2 mL，加入6%苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，空白对照以蒸馏水代替待测液，摇匀后沸水加热10 min，冷却后，在490 nm处测定吸光值为A。
查标准曲线，算出总糖含量。
m(g)=V(A−b)/a
1000000V1。
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖原理硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法。
它基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的原理。
本文将详细介绍硫酸苯酚法的测定原理及操作步骤。
一、原理多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物，同时伴随着苯酚的生成。
苯酚在测定中以红色产物的形式存在，其吸光度与多糖的含量成正比。
因此，通过测定红色产物的吸光度，就可以确定多糖的含量。
二、操作步骤1. 样品处理：将待测的多糖样品溶解于适量的水中，并进行适当的稀释，使得多糖浓度在硫酸苯酚法的线性范围内。
确保样品中没有其他干扰物质的存在。
2. 反应体制：将样品溶液与硫酸苯酚试剂混合，加入适量的浓硫酸，混匀后放置于水浴中加热。
加热时间一般为5-10分钟，加热温度为100-110摄氏度。
3. 冷却与测定：将反应体系冷却至室温后，使用紫外可见光谱仪或分光光度计测量红色产物的吸光度。
根据预先建立的标准曲线，可以计算出多糖的含量。
三、注意事项1. 操作过程中要注意安全，避免与浓硫酸直接接触，避免产生有毒气体。
2. 硫酸苯酚试剂需保存在避光的环境中，避免暴露于阳光下。
3. 加热过程中要控制温度，避免过高温度导致产物分解。
4. 测定前要校准光谱仪或分光光度计，确保准确测量吸光度。
四、优缺点硫酸苯酚法作为一种测定多糖含量的方法，具有以下优点：1. 简单易行：只需准备少量试剂和仪器设备，操作简便。
2. 灵敏度高：对于大多数多糖具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度的多糖。
3. 可靠性好：经过多次验证，该方法的准确性和可重复性较高。
然而，硫酸苯酚法也存在一些局限性：1. 只适用于含有醛基的多糖：该方法只对具有醛基的多糖有效，对于其他类型的多糖则不适用。
2. 反应条件严格：反应温度和时间需要严格控制，否则会影响测定结果的准确性。
3. 有干扰物：一些其他物质可能与硫酸苯酚反应产生类似红色产物，从而干扰多糖的测定。
硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，其原理基于多糖与硫酸在高温下反应生成脱水缩合物的特性。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
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实验硫酸苯酚法测多糖
含量
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实验一
硫酸－苯酚法测多糖含量
1．目的要求
2．测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量
3．2．方法原理
4．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
5．3．主要实验仪器及材料
6．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
7．４．掌握要点
8．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
9．５．试剂配制
10．1）葡萄糖标准液的配制
11．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
12．2）90%苯酚液的配制
13．准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存
3）6%苯酚液的配制
将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤
7.管号 0 1 2 3 4 5 6 7
8.葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0
9.苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10.浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
11.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程
12.2）待测样品多糖的测定与计算
13.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
二、实验原理
游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。
用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。
三、实验材料
1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。
研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。
四、实验试剂
1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。
2．标准葡萄糖溶液(0.1mg-m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1 000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3．6mol-L HCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。
4．10％NaOH溶液：称取10g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。
五、操作步骤
1．葡萄糖标准曲线的绘制
取干净试管6支，按下表进行操作。
以吸光度为纵坐标各标准液浓度(mg-m1)为横坐标做图。
2．样品中还原糖的提取和测定
称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。
于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。
过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
（样品液显色后若颜色很深，其吸光度超过标准曲线浓度范围，则应将样品提取液适当稀释后再加蒽酮显色测定）。
标准曲线的制作及样品测定参考表
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#（样品） 8#（样品）
标准葡萄糖溶液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 还原糖总糖
蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
样品液(ml) - - - - - - 1.0
1.0
糖溶液浓度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 待测待测
置冰水浴中冷却
蒽酮试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
4.0
沸水浴中准确加热10min，取出，用自来水冷却，室温放置10min
A620nm
3．样品中总糖的提取、水解和测定
称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。
再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解半小时，冷却后用10％NaOH溶液中和pH呈中性。
然后用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml，用蒸馏水定容100ml，成稀释1000倍的总糖水解液。
取lml总糖水解液，测定其还原糖的含量：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。
六、实验结果
按照下列公式分别计算植物原料干粉中还原糖和总糖的质量分数（ω）。
ω（还原糖）= （C1V1/m）×100％
ω（总糖）= （C2V2/m）×0.9①×100％
式中ω（还原糖）：还原糖的质量分数（％）；ω（总糖）：总糖的质量分数（％）；
C1：还原糖的质量浓度（mg/ml）；
C2：水解后还原糖的质量浓度（mg/ml）；
V1：样品中还原糖提取液的体积（m1）；
V2：样品中总糖提取液的体积（m1）；
m ：样品质量（mg）。
注①：计算总糖含量的公式，在测定干扰杂质很少、还原糖含量相对总糖含量很少时适用，乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖量中，扣除水解时所消耗的水量。
七、注意事项
1．总糖：食品中的总糖通常是指具有还原性的糖（葡萄糖,果糖,乳糖,麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的糖的总量。
2．本法适用于可溶性还原糖测定。
测定结果是还原性糖和能水解为还原性糖的总和。
3．如要求结果中不含淀粉，则样品处理不应用高浓度酸，而应改用80%乙醇。
4．如提取液中有较多的可溶性蛋白，必须先除去蛋白。
5．若样液较深，可用活性碳脱色。