苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
多糖含量测定实验报告
一、实验目的1. 掌握多糖含量测定的原理和方法。
2. 熟悉实验仪器的操作。
3. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理多糖是一类由多个单糖分子通过糖苷键连接而成的生物大分子。
多糖含量测定常用的方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。
本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，其原理是：在酸性条件下，多糖与苯酚发生缩合反应，生成紫色化合物，通过比色法测定其吸光度，从而计算出多糖含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准葡萄糖溶液（浓度已知）- 标准多糖溶液（浓度已知）- 待测多糖样品- 苯酚、硫酸、盐酸等试剂2. 实验仪器：- 紫外可见分光光度计- 电子天平- 恒温水浴锅- 移液器- 离心机- 烧杯、试管、容量瓶等四、实验步骤1. 准备标准曲线：- 取7支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL标准葡萄糖溶液，用蒸馏水定容至1mL。
- 每支试管加入0.5mL苯酚-硫酸混合液，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
- 取出冷却，加入5mL蒸馏水，混匀。
- 以蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 测定待测多糖样品：- 取3支试管，分别加入0.1mL待测多糖样品、0.1mL标准多糖溶液和0.1mL 蒸馏水，用蒸馏水定容至1mL。
- 每支试管加入0.5mL苯酚-硫酸混合液，混匀，置于恒温水浴锅中加热10分钟。
- 取出冷却，加入5mL蒸馏水，混匀。
- 以蒸馏水为空白，在波长620nm处测定吸光度。
3. 计算待测多糖含量：- 根据待测多糖样品的吸光度，从标准曲线中查得相应的葡萄糖浓度。
- 根据待测多糖样品的体积和浓度，计算待测多糖含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：- 标准曲线呈线性关系，相关系数R²=0.999。
2. 待测多糖含量的测定：- 待测多糖样品的吸光度为0.632，查得相应的葡萄糖浓度为0.5mg/mL。
3. 待测多糖含量的计算：- 待测多糖含量为0.5mg/mL。
苯酚硫酸法测多糖
采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[10-11]。
标准曲线的制作：精确称取经干燥至恒重的标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至100mL，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以蒸馏水补至2mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0mL，再迅速加入浓硫酸5.0mL，水浴15分钟后显色彻底，在冷水中冷却，至室温后在波长490nm处测定吸光度，以水代替糖溶液作空白对照，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标制作标准曲线。
样品测定：取定容液1mL于试管中，稀释10倍即加入蒸馏水9mL得样品液，吸取该多糖样品溶液1mL按标准曲线制作步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算多糖含量。
表2 葡萄糖标准曲线设计方案
根据以上表格数据作葡萄糖标准曲线，如下：。
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸法是常用的多糖含量测定方法之一。
该方法基于多糖在硫酸的作用下，与苯酚产生颜色反应的原理，利用光度计测定反应产物的吸收值，从而计算出多糖的含量。
步骤如下：
1. 取样品0.1g，在50ml锥形瓶中加入5ml去离子水，振荡
20min溶解。
2. 加入2ml 5%苯酚水溶液，振荡均匀。
3. 加入5ml浓硫酸，使用磁力搅拌器搅拌1-2min。
4. 将混合物放置在冷水中冷却10min。
5. 用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度A，同时以含有相同试验液体积的去离子水为对照。
6. 计算样品中多糖含量。
该方法测定简便，精度高，适用于多糖含量较高的样品。
但此法不能区分多糖的种类及其组成，不能应用于含非多糖的样品中。
改良的苯酚_硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究
了几种单糖对葡萄糖的吸光度校正系数 k′i, 并用它们计算寡糖或多糖的 含量。结 果: 对 4 种寡糖和 4 种多糖 ( 包括
·550·
Chin P harm J , 1996 Sep tember , Vol . 31 No. 9 中国药学杂志 1996 年 9 月第 31 卷第 9 期
速, 用于甘草酸的定量研究更为准确, 有较高准
确度及精密度, 能准确地反映制剂中甘草酸的
含量, 可用于质量控制。 3. 3 实验结果表明: x- 为 99. 7% , s 为1. 97% ,
RSD 为 1. 8% , 实验精密度 高, 符合统计 学原
理。
同时, 根据药品质量及生物测定的要求, 在
概率( P = 0. 95) [ 4] 下, 可信度及可 信限率分别
浓度呈线性关系, 从而可用比色法测定其含量。 copyranose) 为 Sigma 产品。可溶性淀粉( 中国
对于匀多糖, 可直接以其组成糖作标准曲 线[ 4] 。但对于由不同糖残基构成的杂多糖, 情况
医药公司) , 经 Sephadex G-200 凝胶过滤柱层 析进一步纯化。香菇多糖( lent inan) 、酵母甘露
RSD (% )
0. 8 0. 6 1. 3 1. 2 1. 1 0. 9 0. 7
3 结果与讨论 3. 1 甘草制剂是一种多组分的复合制剂, 在本 文实验条件下, 其它组分不干扰甘草酸的分离 与测定。 3. 2 甘草酸有效成分的提取是利用甘草酸的 溶解性, 即甘草酸易溶解于热醇、热水溶液, 加 之利用超声波而提取。处理方法简单, 测定迅
酸的含量, 用对照品加入量计算回收率, 平均回 收率 99. 7% , RSD 为 1. 8% 。 2. 2. 4 精 密度 实 验: 取不 同 浓 度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶液, 各进样 10 次, 测得日内 RS D。取不同浓度 8, 12, 18 mg/ 10 ml 的标准溶 液, 样品每天测定 1 次, 进样 10 Ll, 连续 5 d, 求 得日间 RS D。结果见表 1。
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖是一种常用的多糖测定方法，其原理基于多糖与硫酸苯酚反应产生显色化合物的特性。
在测定中，首先将待测样品中的多糖加入到试管中。
然后，向试管中逐渐加入浓硫酸，并快速而彻底地混合。
硫酸的加入会引发多糖与硫酸之间的酸水解反应，生成大量的醛基。
随后，加入苯酚试剂，苯酚与醛基反应生成的有色化合物会根据多糖的种类和含量而呈现出不同的颜色。
颜色的深浅可以通过分光光度计进行测量，从而得到多糖样品中多糖含量的定量结果。
该方法的优点是简单、快速，且对多糖具有较好的选择性。
然而，需要注意的是，在进行测定时应严格控制硫酸和苯酚试剂的加入量和混合程度，以避免反应过程中的误差产生。
总结起来，硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，通过多糖与硫酸和苯酚的反应生成有色化合物来实现多糖的测量。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
实验一硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸苯酚法测多糖含量The pony was revised in January 2021实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．2．方法原理3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
4．3．主要实验仪器及材料5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
6．４．掌握要点7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
8．５．试剂配制9．1）葡萄糖标准液的配制10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
11．2）90%苯酚液的配制12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 78.葡萄糖9.10.苯酚液11.浓硫酸?12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL 软件求得回归方程13.2）待测样品多糖的测定与计算14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚-硫酸法测多糖含量
苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。
再以比色法测定。
试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。
3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。
（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。
5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。
7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意：总的溶液不要超出10毫升。
（既不要超出离心管的容量）。
②离心，转速3000转/分钟，共三次。
第一次15分钟，取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。
因为其脂肪含量大容易夹带残渣。
）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。
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随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理
苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法
２．１ 标准溶液的配制
精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制
将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制
称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择
２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
另取供试品液和对照品液０．６ｍＬ各５份，分别加苯酚液１．０ｍＬ，再分别滴加浓硫酸２．０，３．０，４．０，５．０，６．０ｍＬ，并均用水稀释至８．０ｍＬ，根据Ａ的稳定性，计算硫酸的最佳加入体积。
２．４．３ 反应时间选择及稳定性 分别取供试品液和对照品溶液１．０ｍＬ４份，各加苯酚液１．０ｍＬ，浓硫酸５．０ｍＬ，于选定温度分别恒温１０，２０，３０，４０ｍｉｎ。
测得Ａ值，加热到一定时间以后，Ａ值不再变化，说明加热该时间即可使反应完全。
另测反应完成后样品在不同时间内的Ａ值，结果应在１ｈ以上稳定。
２．５ 标准曲线的绘制
依据２．４确定的测定条件，精密吸取葡萄糖标准
苯酚－硫酸比色法测定多糖含量张青 张天民 （山东正大福瑞达制药有限公司 济南 ２５００１４）
溶液０．０，０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８ｍＬ（相当于葡萄糖０．０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００ｕｇ），分别置于１０ｍＬ具塞刻度试管中，各加水使成１．０ｍＬ，然后分别加入苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸，振摇５ｍｉｎ后置相应温度水浴中加热一定时间，取出置冷水中冷却，最后加水至刻度，摇匀。
用分光光度计在波长４９０ｎｍ处测定吸光度。
以Ａ值对浓度Ｃ绘制标准曲线，进行线性回归，得标准曲线方程：Ａ＝ａ·
Ｃ＋ｂ（ａ、ｂ根据实验确定）。
２．６ 校正因子的测定
将样品多糖纯品适量，按适当比例稀释，使单糖浓度在标准曲线中Ｃ范围内，作为纯品贮备液。
精密吸取该贮备液１００ｕｌ，照标准曲线制作项下的方法测定Ａ，求出样品多糖的浓度Ｃ（ｕｇ／ｍＬ），按ｆ＝Ｗ／（Ｃ·Ｄ）计算换算因子。
式中Ｗ（ｕｇ）为多糖含量；Ｄ为纯品的稀释倍数。
若样品多糖无纯品，如可能进一步纯化，则将样品进行提纯后用于测定校正因子。
２．７ 样品的测定
取样品适量，精密称定，稀释，按照２．５中条件进行测定，得到多糖浓度Ｃ，按多糖含量（％）＝［（Ｃ·Ｄ·ｆ）／Ｗ样］×１００％计算多糖含量。
式中Ｗ样为样品重量；Ｄ为样品的稀释倍数；ｆ为换算因子。
３ 讨论
３．１ 用分光光度计测定多糖的方法，具有操作简单、结果稳定、灵敏度高等优点。
３．２ 文中样品用量、葡萄糖标准溶液用量及供试品贮备液用量，可根据实际情况进行调整，使Ａ值保持在灵敏范围内，保证样品浓度在标准曲线Ｃ范围内，以免测定结果偏离真实值，但各溶液的用量前后尽可能不要变化太大。
３．３ 含多糖的物质，由于其多样性，水解为单糖的难易程度不同，故水解的条件应事先确定。
水解不够，单糖不能充分释出；水解条件过度，释出的单糖或有关糠醛衍生物会被部分破坏。
测定条件选择的三个影响因素，可进行Ｌ９（３４）正交试验来确定最佳条件。
测定条件选择中各影响因素的不同水平可根据样品自身条件进行调整，如反应温度常有煮沸、４０℃和室温等，但室温放置在不同气候条件下影响因素不恒定，因此不多用。
３．４ 关于校正因子的测定，如样品无法进一步纯化，即不能制得多糖纯品，可不进行校正因子测定。
根据得到的多糖浓度Ｃ和Ｗ样、Ｄ直接计算多糖含量（％）。
３．５ 葡萄糖与其它单糖的显色反应虽一般大致相近，
但有一定差异。
故要求较高的测定中，应加以校正［３］。
因其他单糖的显色反应有的比葡萄糖强，有的比葡萄糖弱，误差可抵消一部分。
如不加校正，也可基本上达到多糖含量控制的目的。
３．６ 如果供试品溶液有较深的颜色，溶液中有其它组分在波长４９０ｎｍ处有吸收，则可采用导数法［４］测定含量。
３．７ 试验需进行精密度试验、重现性试验和回收率试验。
参考文献
［１］Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ，Ｇｉｌｌｅｓ ＫＡ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｏ－ｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，１９５６，２８：３５０［２］Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ，Ｇｉｌｌｅｓ ＫＡ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆｓｕｇａｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５１，１６８：１６７
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［４］耿霞，梁冰，梁玉祥等．苯酚－硫酸导数光谱法快速测定中药中多糖的研究，四川大学学报，２００２，３４：６２。