基因组序列拼接
生物信息学大实验_实验指导
实验1基因组序列组装（软件CAP3的使用）一、实验目的1．了解基因组测序原理和主要策略；2．掌握CAP3序列组装软件的使用方法。
二、实验原理基因组测序常用的两种策略是克隆法（clone-based strategy）和全基因组鸟枪法（whole genome shotgun method）。
克隆法先将基因组DNA打成大的片段，连到载体上，构建DNA文库；再对每一个大片段（克隆）打碎测序。
序列组装时先组装成克隆，再组装成染色体。
克隆测序法的好处在于序列组装时可以利用已经定位的大片段克隆, 所以序列组装起来较容易, 但是需要前期建立基因组物理图谱, 耗资大, 测序周期长。
全基因组鸟枪法测序无需构建各类复杂的物理图谱和遗传图谱，采用最经济有效的实验设计方案，直接将整个基因组打成不同大小的DNA片段构建Shotgun文库，再用传统Sanger测序法或Solexa等新一代测序技术对文库进行随机测序。
最后运用生物信息学方法将测序片段拼接成全基因组序列。
该方法具有高通量、低成本优势。
序列组装时，先把把单条序列（read）组装成叠连群（contig）、再把叠连群组装成“支架”（scaffold），最后组装成染色体。
本实验将练习在Linux环境下用CAP3软件组装流感病毒基因组。
1．CAP3序列组装程序简介Huang Xiaoqiu. 和 Madan，A. 开发的一套用于序列拼接的软件，此软件适用于小的数据集或 EST 拼接，它有如下特征：1. 应用正反向信息更正拼接错误、连接contigs。
2. 在序列拼接中应用 reads 的质量信息。
3. 自动截去 reads5`端、3`端的低质量区。
4. 产生 Consed 程序可读的ace 格式拼接结果文件。
5. CAP3 能用于Staden软件包的中的GAP4 软件。
2．下载此软件可以免费下载，下载地址：http：///download.html。
填写基本信息表格，即可下载。
序列拼接
序列拼接* 为了保证测序结果的准确性，单基因短片段（700pd左右）测序一般应采用双向测序，然后将双向测序的结果拼接在一起，从而获得一致性序列。
线粒体基因组测序和DNA长片段测序一般是通过分段测序来完成的，最后也需要将测出的短片段拼接成一条完整的序列。
序列拼接可以在不同的软件中进行。
一、使用“组装批处理文件byLHM.pg4”进行拼接1. 在预定的位置建立一个文件夹“gap”，将需要使用的3个软件“组装批处理文件byLHM.pg4”、“V ector_primer4pMD18-T.vec_pri”、“pMD18-T_Vector.seq”拷贝到该文件夹下，再将需要拼接的测序文件拷贝到该文件夹下。
2. 双击运行“组装批处理文件byLHM.pg4”程序。
3. 在程序运行后出现的界面右侧点击“Add files”按钮，打开要拼接的序列文件。
为了保证拼接后输出的是正向序列，最好先添加上游引物序列，然后添加下游引物序列，因为在一般情况下软件将添加的第一条序列默认为正向参照序列；有时由于测序效果等因素的影响，有时即使首先添加的是上游引物序列，但拼接后仍然会以测序效果明显更好的下游引物序列为正向参照序列，此时需要按照后面介绍的方法将上游引物序列转换为正向参照序列再输出一致性序列。
4. 点击界面上方第二行的“Configure Modules”，在弹出的窗口左边的任务栏中点击“[x]Sequencing vector Clip”，再点击右边的“Browse”按钮，通过弹出的窗口打开“Vector_primer4pMD18-T.vec_pri”程序；点击左边任务栏中的“[] Cloning Vector Clip”，再点击右边的“Browse”按钮，通过弹出的窗口打开“pMD18-T_Vector.seq”程序；点击左下角的“Run”按钮，即开始数据处理，处理结果将自动保存到“gap”文件夹中。
5. 在“gap”文件夹中双击“AssMit_tmp.o.aux”文件，将鼠标移到弹出的“Contig Selector”窗口中的直线上，点击右键，选择“Edit Contig”，即弹出“Contig Editor”窗口，点击最右边的“setting”按钮，在下拉菜单中选择“By background colour”，即可显示比对结果的有差异碱基；双击某一序列，即可显示该序列的测序峰图，以检查核对该位点碱基的测序情况。
二三代基因组混合组装流程的搭建与序列拼接并行优化方法研究
二三代基因组混合组装流程的搭建与序列拼接并行优化
方法研究
二三代基因组混合组装流程的搭建与序列拼接并行优化方法研究，主要涉及以下几个步骤：
1. 安装MaSuRCA软件：按照给出的安装路径，下载并安装MaSuRCA软件。
MaSuRCA是一种常用于基因组混合组装和序列拼接的软件。
2. 准备数据：将二代和三代测序数据准备好，包括原始的测序reads和相应的质量控制数据。
3. 配置参数：根据具体的测序数据和预期的基因组大小，配置MaSuRCA 软件的参数。
这些参数包括可用核数、测序文件位置等。
4. 运行MaSuRCA：使用配置好的参数运行MaSuRCA软件进行基因组混合组装和序列拼接。
5. 结果分析：根据MaSuRCA软件输出的结果，进行详细的分析和解读。
这包括评估组装质量和序列拼接效果，以及识别可能存在的问题和挑战。
6. 优化并行化：为了提高基因组混合组装和序列拼接的效率，可以尝试对MaSuRCA软件的并行化进行优化。
这可能涉及调整并行计算参数、优化任务调度等方面。
7. 评估并行化效果：通过对比优化前后的运行时间和性能表现，评估并行化优化的效果。
如果效果良好，可以将并行化方法应用到其他类似的基因组组装和拼接任务中。
请注意，这只是一种可能的流程和思路，具体的实施可能因数据特点、需求差异和个人经验而有所不同。
在进行基因组混合组装和序列拼接时，还需要注意遵守相关法律法规和伦理规范，确保研究过程合法合规。
基因序列拼接算法设计(精)
１ ． ２ 分析模块
分析模块包括对输入的数据进行预处理如数据中小写字 母统一转换为相应的大写字。然后根据杂交匹配出的探针， 利用字符串的相关操作命令， 拼接重组出靶序列的互补序列， 再对互补序列字符串中的 Ａ与 Ｔ 、 Ｇ与 Ｃ进行互补替换， 得到 靶序列。
收稿日期： ２ ０ ０ ９ － １ ０ － ０ ８ 。国家自然科学基金（ ３ ０ ６ ７ １ ８ ７ ２ ， ３ ０ ７ ７ １ ８ ９ ９ ） 。
图３ 拼接分支示意图
１ 软件主要功能模块与结构
１ ． １ 数据输入模块
该模块实现匹配探序列的输入功能， 由于测序结果通常是 以文本文件提交， 因此设计了可读入文本格式数据的功能。 另外， 为了验证软件的分析是否正确， 还设计了随机生成给 定长度 Ｄ Ｎ Ａ序列的功能， 同时根据生成的 Ｄ Ｎ Ａ序列和设定的 探针长度， 自动得出匹配探针， 以便后续的拼接处理， 主研领域： 信号与信息处理， 图像处理。
第 ５期 １ ． ３ 拼接的处理过程
刘国庆等： 基因序列拼接算法设计
２ ５
分支继续进行拼接。例如在图 ３中， 分支点 １处的位置为 １ ０ ， 用 Ｐ Ｕ Ｓ Ｈ函数将数字 １ ０压入堆栈， 然后将分支点 １处的 Ａ 、 Ｇ字符 排序， 选择字符 Ａ继续进行拼接。到分支点 ２处时， 该处位置 为１ ５ ， 将该数字压入堆栈， 选择字符 Ｃ继续进行拼接。 当拼接出来的 Ｄ Ｎ Ａ链满足一定条件（ 此条件将在第 ３节中 讨论） ， 则输出结果并存入列表框控件中。并且检查堆栈中有 无数据， 如果有， 则弹出堆栈中最上面的数据 （ 即最后压入栈 的） ， 得到分支位置。然后根据此位置数据， 进行如下操作： （ １ ） 从已拼接的 Ｄ Ｎ Ａ链中获取该位置前的字符串， 以便从 该处开始拼接； （ ２ ） 从已拼接的 Ｄ Ｎ Ａ链中获取该位置前 ４个字符（ 即探针 长度减 １ ） ； （ ３ ） 从匹配探针列表中， 查找前 ４个字符与第 ２步中所得 的字符串相同的匹配探针， 从已拼接的 Ｄ Ｎ Ａ链中判断该探针是 否已使用， 如果未使用， 则用该探针继续拼接。 重复按上面的步骤， 直到堆栈为空， 拼接结束。 这一算法是将所有匹配探针作为起始探针进行尝试拼接， 计算量明显比较大， 可以考虑在靶 Ｄ Ｎ Ａ链的 ５ ’ 端挂一较短长 度且碱基序列已知的寡核苷酸片段。由于 Ｄ Ｎ Ａ链的 ５ ’ 端是起 始端， 因此该链和基因芯片进行杂交匹配后， 起始匹配探针必定 是所挂的寡核苷酸片段互补序列的前端部分， 从该探针开始拼 接， 可以大幅减少拼接运算的计算量。
基因组测序与序列组装
基因组测序与序列组装
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基因组测序与序列组装
本章内容结束，谢谢!
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E2f5
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E2f6
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假基因(Pseudogene)
起源于功效基因 但已失去活性DNA序列
产生假基因原因有: 1. 由重复产生假基因; 2. 加工假基因, 由RNA反转录为cDNA 后再整合到
基因组中; 3. 残缺基因(Truncated gene)
基因组测序与序列组装
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重合基因:
动物
真菌 等 细菌
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重复次序
➢ 高度重复次序： 长度：几个——几千个bp 拷贝数：几百个——上百万个 首尾相连，串联排列
集中分布于染色体特定区段（如端粒，着丝粒等）
也称卫星DNA
➢ 中度重复次序： 普通分散于整个基因组中； 长度和拷贝数差异很大
➢ 单一次序：
基因主要位于单一次序
动物中单一次序约占50％
一些已绘制了遗传图与物理图微生物基因 组测序中也采取这一方法.
如高等植物拟南芥基因组测序完全依据克 盛大叠群，先进行各个BAC克隆随机测序，再 进行序列组装；
水稻基因组测序计划采取策略与此相同.
基因组测序与序列组装
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4.3 指导测序与序列组装
建立在基因组图谱基础上”鸟枪法”,即所谓”指导 鸟枪法”或”指导测序”。
基因组测序与序列组装
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基因组测序与序列组装
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3.4 非常规测序
毛细管电泳
用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，节 约时间，加紧测序进程，其它程序同链终止法或 化学测序法。
基因组测序与序列组装
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处理大规模基因组数据的生物信息学方法研究
处理大规模基因组数据的生物信息学方法研究一、前言随着高通量测序技术的快速发展，基因组学的研究进入了一个全新的时代。
随之而来的大规模基因组数据需要应用生物信息学方法来处理和分析。
本文将从序列质量控制、数据预处理、基因组组装和注释、差异基因表达等方面系统性分析目前处理大规模基因组数据的生物信息学方法。
二、序列质量控制在进行大规模基因组数据处理之前，必须要先进行序列质量控制。
常用的序列质量控制工具包括Trimmomatic、FastQC、PRINSEQ等。
Trimmomatic可以对测序数据进行质量控制和预处理，可以去除Illumina PE/SE测序数据中的低质量序列、带接头序列、包含低质量碱基（含未知核酸“N”的碱基）的序列等。
通过对测序数据进行预处理，可以去除掉一些误差的序列，提高后续分析的准确性。
FastQC可以用于对高通量测序数据进行质量控制，可以检测碱基质量、N碱基比例、GC含量、序列长度分布、过多序列等情况。
FastQC还可以进行可视化，在可视化结果中，可以更加直观地查看数据质量，进一步筛选有用的数据。
PRINSEQ可以对高通量测序数据进行过滤和删除，保证后续分析所使用的测序数据的准确性。
PRINSEQ与FastQC相似，可以对碱基质量、N碱基比例、序列长度分布等进行分析，从而更好地去除数据中的误差序列。
三、数据预处理数据预处理是指对序列数据进行去除接头、低质量序列和多余序列等处理。
在数据预处理时，可以根据实际情况选择不同的软件进行处理，如FastX-Toolkit、FastQC、Trimmomatic等。
FastX-Toolkit 可以对序列数据进行去除接头、过滤和修剪等处理。
可以根据实际情况选择需要去除的区域。
FastQC也可以用于数据预处理，可以去除Illumina数据中的低质量、带接头和GC偏向序列。
通过对数据预处理的正确选择和使用，可以进一步提高数据质量和分析准确性。
Trimmomatic可以对接头、低质量碱基、短序列和过多序列进行预处理，通过对序列数据的预处理，可以保证后续分析的准确性。
基因组测序
基因组测序 序列的组装 基因序列的诠释
第1节 DNA测序的基本方法
链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
一、 链终止法测序 (the chain termination method)
（一）基本原理
1977年Sanger提出了“终止法”。反应体系 包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶， 分四组进行，每组按一定比例加入一种2 ’ ,3’双脱 氧核苷三磷酸，它能随机掺入合成的DNA链，一 旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端 核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显 影图谱上直接读出DNA序列。
利用基因芯片进行杂交测序的原理
第2节 DNA序列的组装
定向测序 随机测序与序列组装
一、 定向测序策略
定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺 序进行分析 。
传统方法 新方法
1、传统方法
传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确 定小片段的排列顺序，然后将小片段克隆进载 体进行测序和序列分析。
A 克隆于质粒中DNA
DNA克隆到质粒载体中 碱变性或煮沸变性为单链DNA 缺点：有细菌DNA或RNA可能作为假模板或引物
B M13克隆单链DNA
M13 噬菌体颗粒是丝状的，基因组为单链 DNA，在 宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA（正链）在 宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA，用于DNA的 复制，因此这种双链DNA 称为复制型 DNA 。感染宿 主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬 菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。
（二）技术路线
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
大规模基因组数据分析技术
大规模基因组数据分析技术随着科技的发展，生物基因组测序技术不断向前，甚至随着其高通量和低成本的特性，我们现在可以测序一些远古物种的基因组，如最近新闻报道的恐龙的基因组。
这是生物信息学的核心领域，它的目标是使用计算机算法和工具研究生命科学数据，帮助生物学家了解生物系统的基本原理。
今天，我们将着重讲解大规模基因组数据分析技术，它是解决生物学中一个重要的难题：如何从一个巨大的基因组序列中发现有意义的模式和信息，进而了解一些基因组的结构和功能，更重要的是理解这些基因组的相关性，从而为相关研究提供一些有力的支持。
一、数据的处理和分析对于大规模基因组数据，处理和分析是相当复杂的过程，需要整合不同的分析工具和技术。
在本文接下来的部分，我们会重点讲解一些主要的分析方法和工具，以及它们的一些优点和限制。
首先，我们将讨论一些关于“序列比对”的技术。
比对是将一对序列比较并找出它们的相似之处的过程。
比对的过程是将一个或多个序列与一个参考序列进行比较，并分别确定它们的相同和不同之处。
常见的比对算法包括BLAST和Smith-Waterman算法等。
不同算法的选择取决于所需的结果和分析的上下文。
其次，我们需要讨论“序列拼接”的技术。
拼接是将多条短的序列拼接成一条较长的序列的过程。
拼接的过程是通过比对短序列与参考序列，来解决序列断裂的问题。
在拼接的过程中，出现错误的可能性也非常大，因此需要使用一些软件来验证问题。
常见的序列拼接软件包括Newbler和SOAPdenovo等。
另外，我们还需要了解一些关于“序列组装”的技术。
组装是将短片段序列组合成一整条连续性很高的序列的过程。
组装的过程需要使用一些软件包，如SPAdes和Trinity等。
组装的过程也需要处理一些特殊情况，如基因组的大小、重复序列的数量、杂合体的数量等，这些特殊情况会在组装时产生问题。
最后，我们将讨论“序列注释”的技术。
注释是将基因组序列分析出它的基因、蛋白质、外显子、调控序列、转录因子结合位点等功能元件的过程。
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3．序列所在链不确定 由于测序过程中无法确定特定片断属于DNA 双链中的哪一条链上，所以我们在拼接过程中并 不清楚使用的是read的正义链，还是其互补链。
4．重复序列的干扰 DNA序列自身含有高度重复的子序列，它们 一种表现为短序列的串级重复，比如：(GGAA)n。 或AmTn等。另一种表现为大量相似序列(其拷贝数 可达几十万)散布在基因组的各个地方。Repeat 的存在，将导致fragments间overlap的不真实性， 进而产生错拼的结果。因此在拼接过程中耍确定 这些序列的形式及大小，才能保证以高概率恢复 出其在原始真实序列中的位置．
基因组序列拼接
序列拼接
序列拼接任务即将测序生成的reads短 片段拼接起来，恢复出原始的序列。该问 题是序列分析的最基本任务，是基因组研 究成功与失败的关键，拼接结果直接影响 到序列标注，基因预测、基因组比较等后 续任务。 基因组序列的拼接也是基因组研究必须 解决的首要难题。其困难不仅来自它的海 量数据(以人类基因组序列为例，从数量为 10兆级的片断恢复出长度为亿级的原始序 列)，而且源于它含有高度重复的序列。
2．不完全覆盖性 不是所有的碱基被测序的次数都等于 平均测序覆盖度。极端的情况，可能会出 现源基因组序列上部分区域未被测序的情 况(这段区域称为gap)。即，测序的reads 集合不是原始基因组序列一个完整覆盖。 此时需要借助于各种图谱如：基因组指纹 图谱(genome fingerprint map)， 基因组级 物理图谱(genome-wide physical map)，细 胞发生图谱(cytogenetic maps)等协助对 reads进行定位．
拼接算法评价
以上拼接问题的四个难点不仅极大的增 加了解决实际拼接问题的难度，而且从某种 程度上说无法完整地恢复出原始DNA序列来。 即实际上仅能构建出若干个contig(重建的 fragments的一种排列形式，它覆盖基因组 上一段连续区域)这些contig将指导测序项目 finishing阶段的实验方法最终构建DNA完整 序列。
他们都是遵循“overlap-layoutconsensus”的框架。首先，为了构建图。计 算任意两个read间可能的比对情况。其次， 通过去除歧义的或者不确信的边得到较为准 确的图，并在其上寻找非交叉的简单路的集 合，该集合对应于contig的集合。最终，通过 对包含在一个简单路上的所有read进行多序 列比对，为每一个contig构建一个一致性序列 (consensus sequence)。
将每个read和Gk的近似进行比对，寻 求read的最小改变能够使得read的所有nmers包含在Gk的近似集合中。从而构建了 高质量序列，而对于Poor read，直接抛弃， 对Chimeric read(两端在n-mers中但整体不 在的reads)进行特殊处理。
初始的想法是要实现去除reads中的 测序错误的目的，如果知道原始序列G， 那么直接使用测序获得的read和G进行比 较即可。 但是实际上G并不可知，那么退而求 其次， G的序列片断Gk亦可，事实上Gk亦 不可知。所以将所有的read切割成小片nmers，所有Solid的n-mers形成的集合称 为Gk的近似。最后，构造De Bruijn图。
现有算法的主要问题
虽然已经开发了以上的算法，基因组 序列拼接问题尚未彻底解决，以上两类算 法都存在着各自的缺陷。
对于第一类算法来说，实际上是在图中寻找 一条使得评价函数值最优的Hamilton路径，这是 一个NP完全问题。 一般都采用greedy-merging的算法近似求解。 由于这种step-by-step的局部贪心算法，其明显 的局部特性忽略了reads间“长距离”或者整体 性的联系，从而导致了拼接错误，即拼接结果和 真实的DNA原始序列不同。最近研究指出，在对 已知序列的流行性感冒嗜血杆菌基因组的拼接过 程中，无论是Phrap，TIGR Assembler，还是 CAP3，都发生了拼接错误的现象。
目前，国际上对拼接软件的公认评价 标准包括两方面，即重建出的contig的数目 和准确度。我们发展的基因组序列拼接新 算法的目标是在确保准确性的前提下，构 建尽量少的contig，以减少测序后期大量的 人力和财力的投入。基因组序列拼 Nhomakorabea算法研究现状
现在最常用的拼接程序使用的拼接算 法可分成两类，一类是将拼接问题转化为 在图中寻找的Hamilton路径的问题；另一 类是将拼接问题在某种特殊情况下转化成 寻求图中的Euler路径的问题。他们均有其 成功的典型算法。
拼接问题的难点
DNA测序数据有其固有的四个的特点， 他们也正是解决实际的序列拼接问题的难点 所在： 1．测序有误差 2．不完全覆盖性 3．序列所在链不确定 4．重复序列的干扰
1．测序有误差
由于测序技术的局限，难免会出现测序 错误，尤其是在序列的末端，一般错误率 可控制在1％以下。所以对每个碱基一般有 一个正确概率，以质量打分的形式给出。 因此每个ri都有个可信度。而read与read之 间有不同程度的重叠，由此导致有的重叠 可信度高，有的重叠可信度低。
1.转化为Hamilton Path问题
每个DNA片段(read)相当于图中一个结 点，如果两个片段之间存在着重叠(overlap) 关系，则在两个结点之间定义一条边，而沿 着DNA原始序列从头到尾，则必然经过每个 结点一次且仅一次，即是一条Hamilton路径。 一条contig表示图中一条简单路，此类算法 以Phrap，TIGR Assembler，CAP3， GigAssemble等为代表。
2.转化为Euler Path问题
EULER是这类算法的代表。与传统方 法沿着“Overlap—Layout—Consensus” 路线不同，它不计算各个read之间的 Overlap，即没有Overlap步骤。
它的大致想法如下： 为了排除read中的错误，获得ErrorFree的read，将所有的read切割成小片nmers。