基因组序列诠释
基因组学——精选推荐
基因组学1.基因组学包括那些研究内容？（1）结构基因组学：通过基因组作图、核苷酸序列分析，研究基因组结构，确定基因组成、基因定位的科学基因组测序：⾸先将整个基因组的DNA分解为⼀些⼩⽚段，然后将这些分散的⼩⽚段逐个测序，最后将测序的⼩⽚段按序列组装基因组作图：在长链DNA分⼦的不同位置寻找特征性的分⼦标记，绘制基因组图。
根据分⼦标记可以准确⽆误地将已测序的DNA⼩⽚段锚定到染⾊体的位置上。
（2）功能基因组学：利⽤结构基因组学提供的信息和产物，在基因组系统⽔平上全⾯分析基因功能的科学。
功能基因组学的研究内容：(1)进⼀步识别基因以及基因转录调控信息。
(2)弄清所有基因产物的功能，这是⽬前基因组功能分析的主要层次。
(3)研究基因的表达调控机制，分析基因产物之间的相互作⽤关系，绘制基因调控⽹络图。
（3）⽐较基因组学：研究不同物种之间在基因组结构和功能⽅⾯的亲源关系及其内在联系的学科。
⽐较基因组学的研究内容:：（1）绘制系统进化树，显⽰进化过程中最主要的变化所发⽣的时间及特点。
据此可以追踪物种的起源和分⽀路径。
(2)了解同源基因的功能。
(3)对序列差异性的研究有助于认识产⽣⼤⾃然⽣物多样性的基础。
2.基因组学的历史变⾰与发展趋势？（⼀）1900年代以前:前遗传学时代（1）物种进化的⾃然选择学说——达尔⽂进化论。
（2）1865年G.Mendel发表豌⾖杂交实验结果，提出了遗传学的两⼤遗传规律—分离规律和独⽴分配规律，并认为是⽣物体内的遗传因⼦或遗传颗粒控制⽣物性状（⼆）1900—1950年代:经典遗传学时代标志：1900年,孟德尔遗传规律再发现标志着遗传学的诞⽣）⼈们开始把控制⽣物遗传性状的遗传单称为基因。
⽣命科学的研究基本都是围绕着基因来进⾏。
（三）1950—1990年代:分⼦⽣物学时代（前基因组学时代）标志：Watson & Crick 的DNA 双螺旋结构的发现[《Nature》1953.4.25]，标志着分⼦⽣物学时代的开始 F.Crick根据DNA 的X射线衍射图谱，提出了DNA双螺旋结构模型，解释基因复制的机制，从⽽真正开始从分⼦⽔平上研究⽣命活动。
基因组序列注释
上游外显子-内含子边界的共有序列在真正基因中发现的真实序列之间的关系。
2）外显子－内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征如： 内含子的5‘端或称供体位（donor site）常见的顺序为 5’-AG↓GTTAAGT-3’； 3’端又称受体位（acceptor site), 多为5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；
细菌基因组的ORF阅读相对比较简单，错误的概率较少，但单纯的ORF扫描对高等真核生物DNA效果不佳。
内含子使ORF扫描复杂化
内含子的出现给计算机判读基因带来不少问题，对ORF扫描的基本程序的编写要考虑以下几个问题： 1）密码子偏倚； 2）外显子—内含子边界； 3）上游调控序列。
3.1.2 同源基因查询
通过已存入数据库中的基因序列与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基序列及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。
同源有如下几种情况： A. DNA序列某些片段完全相同； B. 开放读码框排列类似，如有等长外显子； C. 开放读码框翻译成的氨基酸序列的相同； D. 模拟多肽高级结构相似。
实 验
数据分析
Mate Pair 测序构建Scaffold 30X的覆盖率 (454&(Solexa or SOLiD))
序列预处理（质量控制） 基因组拼接（基于reference拼接） 注释(基因功能、代谢通路、比较基因组) SNP发现及注释
实 验
数据分析
30X以上的覆盖率 (Solexa or SOLiD)
数据分析
>30X的覆盖率 (Solexa or SOLiD)
序列预处理（质量控制） 基因组分型技术 SNP、Indel、CNV、染色体结构变异及注释 与表型相关的全基因组关联分析和功能连锁性分析
基因组的序列组成
基因组的序列组成
基因组是生物体内全部遗传信息的总和，包括DNA和RNA。
DNA是生物体内主要的遗传物质，而RNA在基因的转录和翻译过程中起关键作用。
基因组的序列组成指的是DNA或RNA中碱基的排列顺序，包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）（对于RNA而言，替代的碱基是尿嘧啶（U）而不是胸腺嘧啶）。
在人类和许多其他生物中，DNA是以双螺旋结构存在的，由两个互补的链构成。
每个链上的碱基以氢键相互配对，A和T之间有两个氢键，G和C之间有三个氢键。
这种特定的碱基配对确保了DNA的稳定性和准确性。
基因组的序列组成是由成千上万个基因组成的。
基因是DNA的特定区域，包含了编码蛋白质或RNA的信息。
基因组的其余部分可能包括非编码RNA、调控元件、反转录转座子等。
整个基因组的序列组成对生物体的发育、生长、功能和遗传特性等方面都具有重要影响。
不同生物体的基因组序列组成存在差异，这也是生物多样性的基础之一。
随着技术的进步，科学家们能够测定各种生物的基因组序列，从而更深入地了解生物的遗传信息和进化关系。
生物信息学中的基因序列分析
生物信息学中的基因序列分析随着现代生物学的发展，基因序列分析变得越来越重要。
基因序列分析指的是利用生物信息学技术对DNA或RNA序列进行解读，以了解基因组、基因功能和蛋白质结构等方面的信息。
为了更好地理解基因序列分析在生物信息学中的作用，本文将从基本概念入手，探讨一些基因序列分析的技术和应用。
基因序列和基因组基因序列指的是DNA包含的基因信息有序排列的序列。
DNA的碱基有4种类型：腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。
每三个碱基组成一组，被称为一组密码子（codon）。
一组密码子对应一个氨基酸，而氨基酸则是构成蛋白质的基本单元。
基因组则是指一个生物体内所有基因的集合。
基因组的大小和组织结构因生物种类不同而异。
基因组分为核基因组和线粒体基因组。
核基因组位于细胞核中，由配对的DNA双链组成；线粒体基因组则位于线粒体内，通常由单环DNA构成。
基因序列分析的技术1.序列比对序列比对是指将两个或多个序列放在一起，进行相似性分析和比较。
目前最流行的序列比对软件包括BLAST、ClustalW、MUSCLE和T-Coffee。
序列比对可以用于确定两个序列之间的进化距离，并确定其中的同源性。
2.基因注释基因注释指的是对基因序列进行解释，以确定基因的位置、结构和功能。
基因注释分为两个阶段：预测和注释。
在预测阶段，基因识别工具（如Glimmer、GeneMark和FGENESH等）可以帮助预测基因的起始和终止位置。
在注释阶段，生物学家可以通过比对已知的基因和蛋白质序列，来确定预测基因的功能。
3.多序列比对多序列比对可以检测到几个序列之间的相似特征，并可以在序列之间创建进化树。
比对多个序列对于分析不同物种或不同基因之间的进化关系非常重要。
基因序列分析的应用1.疾病诊断和治疗基因序列分析可以用于疾病的诊断和治疗。
例如，在癌症研究中，寻找肿瘤相关基因对治疗患者非常重要。
基因序列分析也可以用于预测某些疾病的患病风险，以及确定药物治疗方案。
基因序列分析与注释的研究方法
基因序列分析与注释的研究方法基因序列分析和注释是现代生物学领域中的重要研究方法。
随着科技的不断进步和创新，生物学研究方法也在不断地发展和完善。
在这些方法中，基因序列分析和注释是非常重要的，它们可以帮助我们更好地理解和预测生物的遗传特征。
一、基因序列分析基因序列分析是指首先获取DNA序列，然后对该序列进行分析。
基因序列分析通常涉及到以下的几个方面：基因组比较和分析、拼接和修补、序列质量控制，基因组注释等等。
1. 基因组比较和分析基因组比较和分析是指将两个或多个基因组的序列进行比较，以研究它们之间的相同性或差异性。
比较的方法包括比较DNA的一般结构和功能序列的相似性。
基于比较分析，可以得出生物分类、进化和种群分布等方面的结论。
2. 拼接和修补拼接和修补是指将多个不完整的DNA序列拼接成一条完整的序列，以便进一步的分析。
这个过程需要通过软件和算法来完成，其中最常用的是基于De Bruijn 图的算法。
3. 序列质量控制序列质量控制是指对不同的序列进行质量检测和控制，以确保数据的准确性和可靠性。
序列质量控制的方法包括使用质量峰（Phred）分值、去除低质量序列和过滤跨越边界的序列等。
二、基因组注释基因组注释是指对基因组序列进行注释，以确定基因的结构、功能和表达。
基因组注释通常包括以下内容：基因预测、基因定位、可变剪接分析、调控元件注释等。
1. 基因预测基因预测是指通过软件和算法对未知的DNA序列进行分析，以确定哪些区域是编码基因。
基因预测提供了对基因组序列功能的了解，同时也是细胞和组织分化以及人类疾病研究的重要基础。
2. 基因定位基因定位是指将基因的位置比对到已知的染色体上，以确定基因在基因组中的位置。
基因定位是研究基因功能和疾病遗传学的基础。
3. 可变剪接分析可变剪接是指同一个基因在不同的组织和环境中通过不同的剪接方式产生不同的mRNA，并通过翻译产生不同的蛋白质。
可变剪接分析可以帮助我们更好地了解基因组的功能，并研究疾病在不同组织中的表达。
解读基因组序列
非编码区变异功能影响预测
基于转录因子结合位点的预测方法
通过分析非编码区变异对转录因子结合位点的影响，预测变异对基因表达 调控的影响。这种方法可以识别出与特定转录因子相关的关键变异。
基于长非编码RNA的预测方法
研究长非编码RNA在基因组中的功能和调控机制，分析非编码区变异对长 非编码RNA结构和功能的影响，进而预测变异对基因表达和表型的影响。
个性化医疗和精准医学发展前景
个体化治疗方案
01
基于基因组序列的解读，医生可以为患者制定个性化的治疗方
案，选择最适合的药物和剂量，提高治疗效果。
精准预防策略
02
通过分析基因组序列，可以预测个体对某些疾病的易感性，从
而制定针对性的预防措施，降低患病风险。
遗传咨询与生育指导
03
解读基因组序列可以为遗传咨询提供科学依据，帮助家庭了解
基于表观遗传学修饰的预测方法
研究表观遗传学修饰在基因组中的分布和功能，分析非编码区变异对表观 遗传学修饰的影响，进而预测变异对基因表达和细胞命运的影响。
实验验证方法介绍
01
基因编辑技术
利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，在细胞或个体水平上对特定基因进
行精确编辑，引入或修复变异，观察表型变化以验证变异的功能影响。
基于比对算法的SV检测方法
通过比对算法识别待测序列与参考序列之间存在大 片段的插入、缺失、倒位或易位等结构变异。
基于组装算法的SV检测 方法
利用组装算法对基因组序列进行组装，通过 比较组装结果与参考序列的差异来检测结构 变异。
05
解读基因组序列：功能影 响预测与验证
变异对蛋白质功能影响预测
基于序列比对的预测方法
02
基因组序列注释
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相似性与一致性
249 MFN-MAI PFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG 232 I LTSL TLPFS AGAYAQALNQQQTTV I S - -T S GS 注: 红色为一致性氨基酸, 蓝色为可取代氨基酸, 白色为趋
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基因注释水平的分类
Known gene(已知基因): 与已知cDNA和蛋白质顺序同源 的基因.
Novel gene(新基因): 与其他物种cDNA或蛋白质同源的 基因.
Novel transcripts(新转录物): 与novel 基因相似, 但缺少明 确的ORF.
Putative gene(可能的基因): 有同源EST支持, 但缺少 cDNA或ORF.
大肠杆菌(E.coli): 4 800 酵母(yeast): 6 200 线虫(nematode): 19 000 果蝇(fly): 13 600 拟南芥(Arabidopsis): 25 000 水稻(rice): 60 000 玉米(maize): 59 000 (估计数) 老鼠(mouse): 30 000
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5.2 基因功能预测
传统的基因功能的研究方法是逐个进行的， 需要通过一系列的突变体筛选、基因功能互 补等遗传学和分子生物学程序予以检测和验 证。
采用生物信息学进行同源性比较来预测基因 功能，蛋白质结构域是预测基因功能的主要 依据。
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基因组测序
基因组测序 序列的组装 基因序列的诠释
第1节 DNA测序的基本方法
链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
一、 链终止法测序 (the chain termination method)
（一）基本原理
1977年Sanger提出了“终止法”。反应体系 包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶， 分四组进行，每组按一定比例加入一种2 ’ ,3’双脱 氧核苷三磷酸，它能随机掺入合成的DNA链，一 旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端 核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显 影图谱上直接读出DNA序列。
利用基因芯片进行杂交测序的原理
第2节 DNA序列的组装
定向测序 随机测序与序列组装
一、 定向测序策略
定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺 序进行分析 。
传统方法 新方法
1、传统方法
传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确 定小片段的排列顺序，然后将小片段克隆进载 体进行测序和序列分析。
A 克隆于质粒中DNA
DNA克隆到质粒载体中 碱变性或煮沸变性为单链DNA 缺点：有细菌DNA或RNA可能作为假模板或引物
B M13克隆单链DNA
M13 噬菌体颗粒是丝状的，基因组为单链 DNA，在 宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA（正链）在 宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA，用于DNA的 复制，因此这种双链DNA 称为复制型 DNA 。感染宿 主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬 菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。
（二）技术路线
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
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1.2 同源查询途径
通过已存入数据库中的基因顺序与 待查的基因组序列进行比较，从中查找 可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于 界定基因的方法称为同源查询。
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同源有如下几种情况：
A DNA序列某些片段完全相同； B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子； C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性； D 模拟多肽高级结构相似
编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密 码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。
不同种属间使用同义密码的频率有很大差 异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多 为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。
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G 外显子－内含子边界
外显子和内含子的边界有一些明显的特征， 如:内含子的5’端或称供体位（donor site） 常见的顺序为 5’－AG↓GTTAAGT-3’； 3’端又称受体位（acceptor site), 多为 5’PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸， T或C)；
(CLONTECH)
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3’RACE
(CLONTECH)
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3.确定DNA序列中基因的位置
A 通过对全长cDNA序列的测序、对比， 以及与基因组DNA的比较，确定基因所 在的区域；
B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定 基因的位置；
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4.实验确认基因功能
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4
B 信号肽分析
信号肽分析软件(SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP )
把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序列翻译 为蛋白序列;
然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个 ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果 SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信 号肽;
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c 基因表达产物丰度的问题
如果风度较低，用拟Northern 杂交和动 物杂交（Zoo-blotting）分析。
拟Northern 杂交—— 根据已知的DNA顺序 设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物， 再以DNA为探针与之杂交。
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动物园杂交—— 根据亲缘关系相似的 物种，其基因的编码区相似性较高，而 非编码区的同源性很低的原理。如果某 一物种的DNA 顺序与来自另一亲缘物 种的DNA片段杂交产生阳性信号，该 区段可能含有1个或多个基因，这种方 法又称为动物园杂交。
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2 获取基因全长cDNA序列A 构建cDNA，用目的基因DNA片段 筛选。
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22整理课件cDNA构建(CLONTECH)cDNA
文 库 构 建
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B 根据已知片段设计引物，RACE 技术得 到基因的全长cDNA序列。
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5’RACE
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C 终止密码子
终止密码子: TAA, TAG,TGA
GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次；
GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出 现一次；
由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最 可能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子。
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D 3’端的确认
第三讲 基因组序列诠释
问题
基因组序列所包含的全部遗传信息是什 么？
基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因、研究基因的功能
呢？
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1. 寻找基因
1.1 根据开放读码框预测基因
A 起始密码子 ATG
第一个ATG的确定(依据Kozak规则);
Kozak规则是基于已知数据的统计结果. 所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列 的碱基分布所满足的统计规律.
另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依 据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpG岛。
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I 软件预测
采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi ) 判断ORF的可能范围。
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H 上游控制序列
几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它 们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。
通过同源性比较来预测mRNA的5’端，最常用的 与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库
(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )。
3’端的确认主要根据Poly(A)尾序列, 若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则 根据加尾信号序列“AATAAA”和 BLAST同源性比较结果共同判断。
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E 非编码序列、内含子
高等真核生物多数外显子长度少于 100 个密码子，有的不到50个密码子 甚至更少；
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F 密码子偏爱性
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1.3 试验分析
Northern 杂交确定DNA片段是表达序列.
注意事项：
a 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由 于连接的外显子不同，会产生好几条长度不 一的杂交带;
如果该基因是某一基因家族的成员也会出现 多个信息；
b 考虑组织专一性和发育阶段的问题；
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Kozak规则:
若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别 标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：
(1) 第4位的偏好碱基为G；
(2) ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱 基T；
(3) 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；
(4) 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏 好碱基。
通过增加基因的 拷贝数和采用强启 动子促使基因超表 达,致使受体表现出 生长与发育的异常, 来研究基因的功能.
4.1 基因剔除(knock-out)
最简便的基因失活的方法.
主要原理:
在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换
基因两侧相同的序列,将这一构建导入目的细
胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取
代靶基因,整合到染色体中.为了便于筛选,用
于取代的外源DNA中含有报告基因.
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4.2 基因超表达