慢病毒载体
慢病毒的简介
慢病毒载体系统的另一个特征是携带病毒微粒 的表面蛋白，包含HIV受体和共受体，从而改变或 扩大的细胞类型的范围，使得该载体可以结合并 且进入。这个模型涉及取代的HIV-1包膜糖蛋白与 另一种病毒的包膜糖蛋白，如疱疹性口腔炎病毒 糖蛋白（VSV-G）。
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1.3. Lentiviral Vector Production
质粒一携带了gag/ pol编码序列及RRE ; 质粒二包含了编码rev的序列; 质粒三是载体质粒; 质粒四表达env。
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3.4自身失活型（SIN）慢病毒载体 SIN载体的构建是在原病毒载体基础上删 除了病毒3’端LTR的U3区增强子和启动子序 列的片段。该区域出现突变则在HIV-1载体 转录后，其5’LTR会因为缺失HIV-1所需要 的启动子和增强子序列而无法复制出完整 长度的病毒基因组。
In SIN vectors, viral promoter activity is deleted
from the inte-grated provirus by deletions in the
U3 region of the 3’ long terminal repeat (LTR)
慢病毒包装
慢病毒包装．慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。
它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。
其中研究最多的是HIV-1慢病毒。
慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。
目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。
与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。
慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。
在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。
慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。
包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G 糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。
用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。
第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
慢病毒载体的构建
慢
慢病毒载体是一种常用的基因转移工具，其安全性评估主要 包括对病毒的毒力、致病性和传播性的评估。在构建慢病毒 载体时，应确保所选用的慢病毒毒株无致病性，且不具有传 播性。
慢病毒载体的生物安全性
在构建慢病毒载体时，应确保载体无外源污染，如细菌、真 菌、支原体等污染。同时，应进行逆转录酶活性检测，以确 保载体无逆转录酶活性，从而避免潜在的基因重组和插入突 变风险。
慢病毒载体的构建流程
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目的基因的克隆
将目的基因克隆到慢病毒载体 中，常用的克隆方法包括限制
性酶切、连接和转化等。
慢病毒载体的包装
将目的基因与包装信号共同转 染包装细胞，包装细胞能够产 生具有感染力的慢病毒颗粒。
慢病毒的纯化
通过离心、过滤等方法将慢病 毒颗粒从包装细胞中分离出来
，并进行纯化。
生物学功能分析
对目的基因进行生物学功能分析， 如报告基因实验、细胞活性实验、 动物模型实验等，以评估慢病毒 载体对目的基因功能的改善效果。
安全性评估
对慢病毒载体进行安全性评估， 包括对宿主细胞的毒性、免疫反 应、致瘤性等方面进行检测，以 确保慢病毒载体的应用安全可靠。
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慢病毒载体的安全性与伦理问题
慢病毒的滴度测定
测定纯化后慢病毒的滴度，即 每毫升或每毫克病毒颗粒的数
量。
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慢病毒载体的设计
包装元件的选择
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包装元件
选择合适的包装元件是构 建慢病毒载体的关键步骤， 包括病毒的复制酶、转录 酶和整合酶等。
安全性
确保所选的包装元件无致 病性，不会对宿主细胞造 成不良影响。
兼容性
确保所选的包装元件与载 体的其他元件兼容，能够 实现有效转导和表达。
制备慢病毒载体
现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。
此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。
瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。
但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。
多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。
转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。
DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。
质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。
不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。
转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。
其它方法有脂质体法和PEI法。
转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。
如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病毒载体。
之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。
储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。
病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。
含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。
一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。
然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。
慢病毒载体相关知识
慢病毒载体相关知识问答Q:什么是慢病毒？A: 慢病毒载体(Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。
慢病毒和细胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞内。
慢病毒RNA 通过逆转录酶转录为DNA。
DNA整合前复合体进入细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。
由于靶基因或基因干扰序列整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因的导入能够获得稳定的表达。
慢病毒的显著优势在于其可以整合到非分裂细胞，而其他载体（如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体）不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂细胞的染色体（如常规的逆转录病毒）。
目前我们使用的慢病毒载体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次改造在包装滴度和使用安全性等方面都非常理想。
在实际的使用中我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着RNAi研究的深入，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列.Q:慢病毒用于RNAi研究A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
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• 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和
整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制 下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
应用前景
1. 获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗 2. 神经系统疾病的基因治疗 3. 血液系统疾病的基因治疗 4. 其他疾病的基因治疗，应用于基 因传递系 统，将治疗基 因运送到 目标部位
病毒载体和慢病毒载体
• 基因转移载体是基因治疗的重要组成部分,包括病毒载体和 非病毒载体。目前应用的病毒载体主要有逆转录病毒载体、 腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病 毒载体等。不同的病毒载体各有利弊。随着对病毒载体的 不断改造完善,提高其基因转移效率和安全性,病毒载体将 在基因治疗中继续发挥重要作用 • 逆转录病毒只能转导分裂期细胞,腺病毒载体在体内不能实 现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。 来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体由于可以 感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反 应小等特点越来越受到人们的重视
基本过程
• 由两部分组成，包装成分和载体成分
• 包装成分：HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合的
顺式作用序列而构建；包装成分通常被分开构建到两个质 粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env 蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装 成分与载体成分的3个质粒共转染细胞即可在细胞上清中 收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因 的HIV-1载体颗粒
• 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌 细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞和一些较难转染的细 胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒 载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，而 且大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组 的几率，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。 • 在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒 己经成为表达外 源基因或外源shRNA的常用载体形式之一。 • P.s shRNA是short hairpin RNA 的缩写。翻译为“短发夹RNA。
4.单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体
单纯疱疹病毒是一种双链DNA病毒,作为基因治疗载体， HSV载体非常 适用于需要基因长时间表达的基因治疗,但在介导肿瘤基因治疗等要求基 因短暂高水平表达的基因转移是不合适。
5.慢病毒(lentivirus)载体
概念
• 慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1)
3.腺相关病毒(adeno-associated virus,AVV)载体
腺病毒相关病毒(AAV)是一种缺陷型的单链DNA病毒,只有在辅助病毒 如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等存在的情况下,才能进行最佳复制, 产生新的病毒颗粒,否则只能进行潜伏感染。AAV载体既可以转染分裂细 胞又可以转染非分裂细胞,在宿主体内以定向整合的方式存在,70%以上的 整合位点位于第19号染色体q13.3-qter区,且对人体无致病性
逆转录病毒载体、腺病毒载体：
1.逆转录病毒(retrovirus vectors ,RV)载体
逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分:一部 分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载 体;另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转 录病毒结构基因
将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿 主细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,可 高效的转染静止细胞,并能抵抗血清补体灭活的作用。
辅助成分
• 辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生 病毒颗粒的细胞系。 • 慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、 重组的假病毒颗粒所需要的所有辅助蛋白。
• 为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染 细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外 的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目 的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水 平的表达效应分子。
来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、 转染、稳定整合的必需遗传信息。
• 携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、 细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的 病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源 基因在细胞或活体组织中表达 • 慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效 地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目 的序列的效果。
目前，最主流的腺病毒载体系统有Adeasy系统（ 通过原 核重组极大提高了腺病毒的重组效率）和AdMax系统（改造 后的真核腺病毒包装体系，进一步增加的操作的便捷，同时 滴度较Adeasy有进一步提高）。
第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列(ITRs)和包装信号,载体容量 达37kb,进一步降低了免疫原性,被称为“高容量”载体。AV载体具有宿主 范围广、基因转移效率高、对非分裂细胞也有感染性、比较容易制备和 操作、理化性质稳定、遗传毒性较低及比较安全等优点。
王烈. 基因治疗病毒载体的研究进展[J]. 医学综述, 2007, 13(7): 490-492.
2.腺病毒(adenovirus, AV)载体
腺病毒是一种二十面体病毒壳体大分子，基因组是一个线性的双链 DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5’端上还具有末端反向重 复序列（ITRs）。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基 因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。
shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由 polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中输送“小 干扰RNA”（siRNA）的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送 入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”（shRNA），并被RNAi通道 处理