DA7600实时荧光定量PCR仪确认方案模板
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
EBV+DNA定量检测在诊断儿童EB病毒感染中的临床意义
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＥＢＶ
ｌｏａｄ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ２０５ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｆｅｖｅｒ．Ａｔｙｐｉｃａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｈａｐｅｄ
ｔｏ ６ ｙｅａｒｓ
０（２＝１．０２４６．Ｐ＝０．３ １ １ ４）．ＥＢＶ
ｏｌｄ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ
ｃａｓｅｓ
ＤＮＡ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｆｒｏｍ ｌ ｔｏ ３ ｙｅａｒｓ ａｎｄ ｆｒｏｍ ４
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｇｅｓ
ｌｙｌｎｐｈｏｃｙｔｅｓ
ｒａｔｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ＥＢＶ ＤＮＡ—ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ
ｆｅｖｅｒ．ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｘ２：３１．３５５１，Ｐ＜０．Ｏ００１）．④Ｔｈｅ ４２
Ｒｅｓｕｌｔｓ：＠Ｔｈｅ
４２ ｏｕｔ ｏｆ ２０５
ｃａｓｅｓ
ｗｉｔｈ ｆｅｖｅｒ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＥＢＶ ＤＮＡ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ２０．５％，ａｎｄ ２３ ｍａｌｅｓ ａｎｄ １ ９ ｆｅｍａｌｅｓ，ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｗａｓｈ’ｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ
目
录
引言……………………………………………………………………………………．１
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告PPT课件
基本概念
标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。 参比（Reference） 用于对检测结果进行标准 化的被动（Passive）或主动（Active）信号。 如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性 参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性参比 有其自己的引物和探针。被动性参比则为非 PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的 非PCR波动。
基本概念
绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是RNA，也可以是双链DNA片段、单链 DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相 比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
人乳头瘤病毒型核酸检测标准操作规程(PCR-荧光探针法)_重复
人乳头瘤病毒6,11型核酸检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）1.目的：规范人乳头瘤病毒(HPV)6,11型核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：PCR实验室。
3.职责：3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1《中山大学达安基因股份有限公司人乳头瘤病毒（6,11型）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书》4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：采用一对特异性引物和一条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测人乳头瘤病毒（HPV）6,11型DNA。
5.3 性能参数：5.3.1 检测下限： 5.0×102基因拷贝/ml。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。
5.4.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
5.4.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
5.4.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
Cycle number
Sample
Ck 104
Ck 102 Lg of DNA concentration
qPCR 常用实验方法
A
B
C
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
SYBR Green I 染料法——原理
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
待Sta测n样da本rd拷cu贝rv数e （copies/ul标）准=待品测样本浓度5×/样1本0分3 子量×268×.110814 28.64
C-不al要ibr有at连or续: 可4以个用G 带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；
输C乙用RHTee入肝Nfa值eol要 病tr-h是eTy查人ne判cRm找血e断NpR的液lAa实Nt蛋中eA验C白Hp成oBo或no功Vtl是r的s与o；l基绝(否N因对的T标标名定C重)准准称量检要品品验参q考PCR体系55××（11引00物45 ）
实验数据 实cD验NA步合骤成：(提两取步H法BVqRDTN-PAC；R)
T9a5q~m1 anS探lop针e法: -—3.—原理
c可D以NA是影含响有q目PC的R基敏因感的度质粒、PCR产物、基因组DNA等。
实时荧光定量PCR仪大型仪器设备购置论证报告材料
实用标准文案
大型仪器设备购置论证报告
仪器设备名称实时荧光定量PCR仪
项目名称生态环境科技平台
项目负责人陈建荣
填表日期2017年4月12日
实验室管理处制
填表说明
1．单价10万元及以上仪器设备的申购均需填写此表，并与
申购计划一起上报有关部门。
2．所在学院（部门）组织3—7人单数技术专家进行论证，并通知项目经费管理、设备管理等部门参加论证。
申请单一来源采购的需3人以上单数非本校专家参加论证；未列入全省统一论证进口产品范围的进口产品需5人以上单数非本校专家参加论证。
3．论证会由专家组组长主持，主要程序为：申购人报告、现场考察、专家质询与讨论、专家组形成论证意见并签名。
4．专家论证同意，经学院（部门）、项目经费管理部门签字并盖章后，报本科教学部（实验室管理处）网上公示一周无异议后实施。
5．此表一式1份（如设备为进口设备，请提交2份）。
乙型肝炎病毒DNA定量检测临界室内质控品的制备与初步应用
乙型肝炎病毒DNA定量检测临界室内质控品的制备与初步应用曹季军;吕心路;许爱萍;杨剑虹;李晓红;王金湖【摘要】目的制备乙型肝炎病毒(HBV)-DNA定量检测的临界室内质控品并评价其在日常工作中的应用价值.方法留取健康体检者血清作为基质,稀释阳性标准品,与临床标本采用实时荧光定量聚合酶链反应一起检测,根据结果计算出x、s、CV 值并在L-J室内质控图上作图,应用Westgard多规则质控判断方法.结果x=3.55×104 copy/mL,s=0.24(对数值),CV=5.27%.结论自制HBV DNA临界质控品结果稳定,具有一定实用价值.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2011(008)022【总页数】2页(P2771-2772)【关键词】乙型肝炎病毒4;荧光定量聚合酶链反应;室内质控品【作者】曹季军;吕心路;许爱萍;杨剑虹;李晓红;王金湖【作者单位】江苏省太仓市第一人民医院检验科,215400;江苏省太仓市第一人民医院检验科,215400;江苏省太仓市第一人民医院检验科,215400;江苏省太仓市第一人民医院检验科,215400;江苏省太仓市第一人民医院检验科,215400;江苏省太仓市第一人民医院检验科,215400【正文语种】中文长期以来，我国人群一直呈乙型肝炎病毒（HBV）高感染率，约有1.3亿人感染[1]，因此乙型肝炎的诊断和治疗显得格外重要。
随着科学技术的发展和基因检测技术的成熟，HBV DNA的检测在乙型肝炎的诊断、治疗和疗效观察方面发挥了不可替代的作用，尤其是实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术。
但是为了保证检测的质量，必须要有严格室内质量控制措施。
因PCR检测结果为指数增长，目前尚无统一的室内质控品。
本实验室根据自身条件，自行制备了HBV DNA室内质控血清，并进行了初步应用和评价，现报道如下。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 血清健康体检者血清，要求无黄疸、无溶血、无脂血，丙氨酸氨基转移酶小于40 U/m L，HBV表面抗原阴性，HBV DNA无扩增趋势。
DA7600实时荧光定量PCR仪确认方案模板
D A7600实时荧光定量P C R仪确认方案模板-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN确认文件类别：确认方案编号：部门：质量部页码：共11页，第2页DA7600PCR扩增仪方案与报告版次：新订替代：起草：年月日审阅会签：（确认小组）批准：年月日目录1.概述 (4)2.确认目的 (4)3.确定确认范围 (4)4.确定确认小组成员及职责 (4)确认小组成员及确认小组负责人 (4)人员 (4)评价方法： (4)标准： (5)5.风险评估 (5)评估概述 (5)评估方法 (5)6.确认内容 (9).安装确认 (9)安装信息 (9)仪器放置检查 (9)操作规程等资料确认 (10)运行确认 (10)基本称重功能确认 .................................................. 错误!未定义书签。
校正功能确认 ........................................................ 错误!未定义书签。
性能确认 ................................................................... 错误!未定义书签。
准确度...................................................................... 错误!未定义书签。
天平重现性检查： .................................................. 错误!未定义书签。
四角偏差检查： ...................................................... 错误!未定义书签。
7确认计划安排....................................................... 错误!未定义书签。
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确认文件
类别：确认方案编号：
部门：质量部页码：共11页，第1页
DA7600PCR扩增仪
方案与报告
版次：新订替代：
起草：年月日
审阅会签：
（确认小组）
批准：年月日
目录
1.概述 (2)
3.确定确认范围 (2)
4.确定确认小组成员及职责 (2)
4.1确认小组成员及确认小组负责人 (2)
4.2人员 (2)
4.2.1评价方法： (3)
4.2.2标准：3
5.风险评估 (3)
5.1评估概述 (3)
5.2评估方法 (3)
6.确认内容 (6)
6.1.安装确认 (6)
6.1.1安装信息 (6)
6.1.2仪器放置检查 (6)
6.1.3操作规程等资料确认 (6)
1.概述
DA7600实时荧光定量PCR仪，是中山大学达安基因公司推出的具有全自动、实时监测、定量分析的DNA荧光检测系统。
结合半导体致冷器实现PCR扩增过程，并通过高灵敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时监测，实现同时对样品的扩增和检测。
友好的全中文计算机界面，可满足不同PCR实验的需求。
其反应速度及准确性、操作实用性和使用灵活性均有较好的提高，能满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求，是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。
它主要有一台DA7600和PC计算机及显示器组成。
2.确认目的
通过用HCV荧光PCR检测试剂盒来确认DA7600实时荧光定量PCR仪的扩增和检测体系精密度、线性、准确度等，验证仪器能否正常准确运行，给出可靠的分析结果，以及48孔孔间差异是否在允许范围内。
3.确定确认范围
本方案适用于DA7600实时荧光定量PCR仪运行确认及性能确认。
4.确定确认小组成员及职责
4.1确认小组成员及确认小组负责人
4.2 人员
列出参加DA7600确认的所有人员名单，评价培训情况是否符合操作的要求。
4.2.1评价方法：
查阅培训档案，确认是否对有关操作者进行了相关培训，包括：
1、DA7600实时荧光定量PCR仪操作，维护保养规程
2、《DA7600中文操作说明书》
3、《GBT 27921-2011 风险管理风险评估技术》
4、确认方案实施培训
4.2.2标准：
在本方案实施前，应对方案实施过程中涉及人员进行培训且考核合格，以保证方案顺利实施。
确认人：日期：
复核人：日期：
5.风险评估
5.1评估概述
作为植入性医疗器械生产企业，产品的质量控制至关重要，而检验仪器又作为质量控制必不可少的设备。
因此，为了进一步提高质量部对仪器的管理水平，发现并尽可能消除一些潜在的风险对实验和检验结果造成的威胁，现依据《GBT 27921-2011 风险管理风险评估技术》标准对本仪器进行风险评估，对存在的缺陷及质量风险给出合理分析和防范措施。
5.2评估方法
本方法采用失效模式和影响分析（FMEA)程序.同时风险识别风险管理小组成员使用头脑风暴法，分析了仪器室可能出现的各种偏离正常的偏差，即潜在的失效模式、失效模式可能造成的影响、该影响对检品质量、安全造成的危害以及这些危害的严重程度、危害发生的可能性及可检测性。
（见表一：仪器室潜在失效模式及分析表）说明：严重程度用1－10的数字来表示，其中，1表示对检测数据几乎无影响；2－4表示对检测数据影响较轻微；5－7表示对检测数据产生中等影响；8－10表示会对检测数据造成严重影响
可能性用1-10的数字表示，其中，1表示几乎不可能发生；2-4表示发生的可能性较小；5-7表示发生的可能性为中等，8-10表示发生的可能性很大。
可检测性用1-10的数字表示，其中，1表示完全可以检测出来；2-4表示在一定程度上可以检测；5-7表示检测的可能性较小；8-10表示几乎无法检测。
5
6.确认内容
DA7600实时荧光定量PCR仪确认工作由质量部有关人员参与实施。
6.1.安装确认
6.1.1安装信息
6.1.2仪器放置检查
复核人：日期
6.1.3操作规程等资料确认
复核人：
日期
6.2运行确认
6.2.1 PC 计算机运行环境确认
运行环境确认内容 检查配套计算机能否正常开机运行，是否有中病毒等现象，能否为DA7600运行软件和分析软件提供安装平台和运行平台。
复核人： 日期 6.2.2DA7600运行软件及分析软件的确认
软件确认内容 双击电脑桌面上的DA7600运行软件及分析软件的图标，看应用软件能否打开，能否正常使用。
6.2.3.1. 灵敏度和线性
6.2.3.1.1方法 利用HCV 荧光PCR 检测试剂盒，取12支HCV 反应管，并分别使用HCV 标准参考品（1.0E4,1.0E5，1.0E6，1.0E7）、阴性对照、空白对照，均做复管，按照说明书的操作步骤进行。
6.2.3.1.2 合格标准 （1）空白对照和阴性对照无起跳 （2）标准参考品标准曲线的相关系数R ≥0.98，复管重复性良好。
6.2.3.1.3 数据记录 6.2.3.2 孔间差异
6.2.3.2.1方法：利用HBV 荧光PCR 检测试剂盒，取出48支反应管，每支分别加入相同的模板HBV 标准参考品1.0E4，同时进行实时扩增检测。
6.2.3.2.2合格标准 （1）空白、阳性对照无起跳 （2）每孔相对偏差值不大于8% 4.3.2.3 数据记录 4.3.2.4 数据分析 孔间差计算方法 CTi ×100% (CT1 +CT2 +CT3 +……CTn)/n
7 异常情况处理
在验证的过程中，应严格按照验证方案操作，若出现个别项目不合格，应查明原因后重新进行验证。
如果属于仪器设备原因，则由验证小组和质量部负责人协同处理或联系厂家进行维修，并填写相应记录。
8 验证最终结果分析和评定
评定人：评定时间：
9再验证周期
9.1 在一般情况下每一年验证一次。
9.2 如更更换仪器零部件或重大维修，完成后均要再次验证，以证明更换零部件及维修对仪器的正常使用没有影响。
9.3 再验证启动时，按照完整程序进行。
10 验证批准批准人：批准时间：。